4. 方法验证参数和试验

4.1 方法验证的参数

USP<1225>规定实验室应采用试验方式进行方法验证：“应通过实验室的研究制定成一定的分析方法验证程序，证明方法的性能参数符合预期的分析应用要求。”不同国家和国际委员会的工作组都对方法验证所要求的试验作出了规定，这些在文献中都有阐述。不幸的是，一些定义在不同的组织间差异很大。为了达到标准化的目的，ICH 来自美国、欧洲和日本的行业和监管机构代表定义了分析方法验证的参数、要求和方法。

表1 典型化学分析方法验证参数的选择

		检测限/检出限	定量限	正确度/回收率	精密度（重复性和再现性）	选择性/专属性	适用性/稳健性/稳定性	线性/灵敏度/范围
定性方法	S	+	-	-	-	+	+	-
	C	+	-	-	-	+	+	-
定量方法	S	+	+	-	+	+	+	+
	C	+	+	+	+	+	+	+
备注：“S”=筛选方法（Screening methods）；“C”=确证方法（Confirmatory methods） “+”=必选参数；

表2 国内外对方法验证参数的要求

参数	对相关参数做出要求的法规、标准
定量限	USP、ICH、ISO/IEC17025、Ch.P （2010版）、SN/T 3266-2012、《化矿金专业化学分析方法验证程序（试行）》（CNCA）、《食品化妆品专业化学分析方法验证程序》（CNCA）、《食品化妆品专业生物检测方法确认（验证）程序》（CNCA）、《化学分析方法验证程序》（征求意见稿，AQSIQ）、《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》（CFDA）、《农药产品质量分析方法确认指南》（征求意见稿，农业部）
检测限/检出限	不含《农药产品质量分析方法确认指南》（征求意见稿，农业部），其他同定量限
准确度/正确度/回收率	同定量限
精密度 l 重复性 l 中间精密度 l 再现性（复现性、重现性）	同定量限； 不含USP，其他同定量限； ICH、《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》（CFDA）； 同定量限。
专属性/选择性/特异性	同定量限；几个术语的定义存在相同或相近之处，USP、ICH称为专属性，ISO/IEC17025称为选择性，某些标准称为特异性，某些标准将选择性定义为包容性和排他性的组合。
耐用性/适用性/稳健性/稳定性	不含SN/T 3266-2012和《农药产品质量分析方法确认指南》（征求意见稿，农业部），其他同定量限；不同标准采用的术语存在差异，但其定义相同或相近
线性	同定量限
范围/测定范围	不含SN/T 3266-2012和《农药产品质量分析方法确认指南》（征求意见稿，农业部），其他同定量限
灵敏度	不含《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》（CFDA）和《农药产品质量分析方法确认指南》（征求意见稿，农业部），其他同定量限

注：1）依据GB/T 3358.2-2009《统计学词汇及符号第2部分：应用统计》（ IDT ISO3534-2:2006）和GB/T6379.1-2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义》（ IDT ISO5725-1:1994）中规定“准确度”的定义为正确度和精密度的组合，而国内目前部分标准中（包括上表）的“准确度”仅等同GB/T 3358.2-2009中的“正确度”，所以上表的准确度与正确度同义，此差异主要是由于国内标准制订引用术语不严谨造成。2）回收率是表示准确度/正确度的一项指标；3）再现性亦称复现性、重现性；4）由于重复性和再现性条件均为精密度的两种极端条件，因此引出中间精密度这一术语，具体定义见GB/T 3358.2-2009。

 

CNAS-CL01:2006和CNAS-CL10:2012对方法确认的具体参数描述已经与表1类似，但确认终究不是验证，因此一般要求对非标准方法参照表1进行验证，而标准方法的确认则适当采用简化程序。

至于每项参数的验证试验具体如何操作，可参考本文后的相关参考文献，这里不做过多阐述。

4.2 方法验证的步骤

某个具体方法的有效性应通过实验加以证明，一般使用与常规分析的未知样品接近的样品或标准品进行验证试验。其准备和执行应按照验证计划进行，最好写成作业指导书。图1为方法验证的参考步骤。

http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/ibSnz6KMOmB0sVQmkGabVwMMU1o2dvqlnwcDUPmZezwWLLfBsVibIHmQJHialh0K5RMPkzpc2Aa285MdUZLu4jxKA/0

图1 方法验证常规步骤

 

5. 方法确认（证实）

ISO/IEC 17025 要求：“应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。”，这些标准方法被认为已经得到验证。因此，许多技术人员错误地认为标准方法不需要在实验室中做任何进一步的验证、证实或试验即可投入使用。US FDA CGMP 法规在21 CFR 211.194 (a)(2)中规定：“如果应用的方法收载于现行的美国药典或其他认可的标准方法中，或在批准的新药应用中有详细方法且未改变这一参考方法时，有指明方法和参考文献的声明即满足要求。所有检测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实。”ISO/IEC 17025 在5.4.2 中有类似的要求：“在引入检测或校准之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行证实。”

这里明确了标准方法只要不发生变更，不需要进行验证，但实验室应确认其有能力成功运行该方法。当决定选择什么样的证实方式最好时，问题又来了。是否需要重做部分验证试验还是全部的验证试验都要重做，或者仅仅系统适用性试验或质控样品结果满意是否足够，这些都不清楚。

USP 在通则<1226>法定方法的确认中回答了这些问题，给出的建议适用于法定方法和标准方法的实施，关键的建议有：

l 通过系统适用性试验证明实验室和系统的性能

l 评价方法的临界性和复杂性

l 选择最重要的方法性能参数

l 根据方法的临界性和复杂性，重复1～3 个最为重要的验证试验

ISO/IEC 17025在5.4.5.2中也给出相应的注解：用于确定某方法性能的技术应当是下列之一，或是其组合：

l 使用参考标准或标准物质（参考物质）进行校准；

l 与其他方法所得的结果进行比较；

l 实验室间比对；

l 对影响结果的因素作系统性评审；

l 根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行的评定。

与内部制定方法的验证相同，标准方法的确认和评价也应该遵循文件化的程序，如确认计划或作业指导书。法定/标准方法的确认过程见图2。

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图2 方法确认的参考过程

那么，确认参数和试验该如何选择呢？参数和试验的选择与应用类型相关，图3为USP <1226>为特定应用推荐的确认试验。

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图3 USP <1226>为药物分析推荐的确认试验

 

图4为AOAC 发布按ISO/IEC 17025 实施标准方法时建议采取的确认试验。

http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/ibSnz6KMOmB0sVQmkGabVwMMU1o2dvqlnSpDiaHPhW8ejm7ibNkVEDDwyZZDSQ3CzStfnFdFBzJ2Oxv7eeezdIU6A/0

图4 AOAC 为特定的应用推荐的确认试验

 

相对于方法验证来说，方法确认类似于方法验证的简化版，且方式更灵活。但是实验室最终该如何做好方法验证或确认，还需要各实验室对相关法规标准及参考文献进行深入的研究，制定适合自身的作业指导书并严格执行，才能在应对认证认可和技术发展两个层面实现双提高。

最后，将方法验证、确认和转移简单总结如下：

表3 方法验证、确认和转移总结

内容	适用范围	目的	发起时机
方法验证	1、采用新的检测方法； 2、检测方法需变更的； 3、采用非法定方法/标准方法； 4、法规标准规定的其他需要验证的检测方法	证明采用的方法适合相应检测要求	1、建立方法时； 2、方法修订时； 3、非标方法批准采用前
方法确认	1、不需要进行验证的检测方法； 2、法定方法和标准方法，比如USP、Ch.P、国际标准、国家标准等方法	确认方法在本实验室条件下的适用性	在实验室批准使用该方法前
方法转移	将方法由A实验室转移到B实验室	确认采用的方法在B实验室条件下的适用性	在B实验室批准使用该方法前

注：本文不讨论关于方法转移的内容，具体可参考相关文献

 

6. 参考文献

1. CNAS-CL01:2006《检测和校准实验室资质认定评审准则》

2. 《实验室资质认定评审准则》（CNCA）

3. 《司法鉴定机构资质认定评审准则》（CNCA）

4. CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》

5. CNAS-CL08：2013《司法鉴定/法庭科学机构能力认可准则》

6. CNAS-CL52:2014《CNAS-CL01<</span>检测和校准实验室能力认可准则>应用要求》

7. CNAS-CL10:2012《检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明》

8. CNAS-CL09:2013《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》

9. CNAS-CL18:2013《检测和校准实验室能力认可准则在纺织检测领域的应用说明》

10. CNAS -CL44:2013《检测和校准实验室能力认可准则在建筑工程检测领域的应用说明》

11. CNAS-CL56:2014《检测和校准实验室能力认可准则在建材检测领域的应用说明》

12. CNAS-CL55:2014《检测和校准实验室能力认可准则在光伏产品检测领域的应用说明》

13. SN/T 3266-2012《食品微生物检验方法确认技术规范》

14. 《分析方法验证指南》（安捷伦科技公司）

15. 《化矿金专业化学分析方法验证程序（试行）》（CNCA）

16. 《食品化妆品专业化学分析方法验证程序》（CNCA）

17. 《食品化妆品专业生物检测方法确认（验证）程序》（CNCA）

18. 《化学分析方法验证程序》（征求意见稿，AQSIQ）

19. 《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》（CFDA）

20. 《农药产品质量分析方法确认指南》（征求意见稿，农业部）

21. GB/T 3358.2-2009《统计学词汇及符号第2部分：应用统计》

22. GB/T6379.1-2004《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义》

23. 《检验分析方法的验证和确认》（黑龙江省食品药品检验检测所培训课件）

24. 《分析方法的验证、确认和转移》（美国USP天津2012年培训课件）