RNA- seq是透过次世代定序的技术来侦测基因表现量的方法，在衡量基因表现量时，若是单纯以map到的read数来计算基因的表现 量，在统计上是一件相当不合理事，因为在随机抽样的情况下，序列较长的基因被抽到的机率本来就会比序列短的基因较高，如此一来，序列长的基因永远会被认为 表现量较高，而错估基因真正的表现量，所以Ali Mortazavi等人在2008年提出以RPKM在估计基因的表现量。

RPKM是将map到基因的read数除以map到genome的所有read数(以million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。

其公式为:

其中，total exon reads / mapped reads (millions) 可以视为所有read 数中有百分之多少是map 到这个基因，然后再除以基因长度，就可以某基因得到单位长度有百分之多少的total mapped read 有表现。

以下就用一个简化的例子来说明RPKM的运用方式与概念:

假设一基因体只有两个基因，一个9 KB，一个1 KB，如今有一sample，其map 到9 KB 的read 有18 million 个，map 到1 KB 的有2 million 个，如下图所示。

对于9 KB 的基因而言，

Total exon reads=18 million

Mapped reads=18+2=20 million

Exon length=9 KB

RPKM =18/(20*9)=0.1

对于1 KB 的基因而言，

Total exon reads=2 million

Mapped reads=18+2=20 million

Exon length=1 KB

RPKM =2/(20*1)=0.1

由此我们可以知道这两个基因表现量没有差别。

假设此时我们有另一个sample，其表现如下图所示:

我 们可以发现此sample中9 KB基因的read数明显比上一个sample少，如果我们计算RPKM可以得到RPKM = 9/((9+1)*9)=0.1，却与上一个sample相同，这可能是因为cDNA浓度较低或是其他sample备制过程的问题，造成整体read变 少，但是对9 KB基因而言，其read数占所有read数的比例并没有发生改变，所以其表现量会和上一个sample相同。

不同点就是FPKM计算的是片段（fragments），而RPKM计 算的是数据（reads）。Fragment比read的含义更广，因此FPKM包含的意义也更广，可以是pair-end的一个fragment，也可以是一个read。FPKM和RPKM RPKM代表每千个碱基的转录每百万映射读取。 FPKM代表每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片。