加载中…
个人资料
微博
  • 博客等级：
  • 博客积分：
  • 博客访问：
  • 关注人气：
  • 获赠金笔：0支
  • 赠出金笔：0支
  • 荣誉徽章：
正文 字体大小：大 中 小

细胞凋亡步骤介绍详解-优宁维

(2016-06-14 09:05:42)
标签：

优宁维

细胞凋亡

 分类： 知识库
Apoptosis小百科
http://s15/mw690/0027k3KGgy72t1PEsmW0e&690
为程序性细胞死亡，起因可能因为外界环境、生长发育等因素而导致自然死亡现象。当细胞发生apoptosis时，会发生细胞膜PS由内外翻至细胞外、线粒体膜电位改变、Caspase活化。DNAfragmentation,一连串的反应使细胞裂解形成凋亡小体，被巨噬细胞识别并清除。
Step 1：Annexin V binding assay / 细胞膜 PS 外翻
凋亡细胞在早期Phosphatidyl-serine(PS)会由细胞膜内外翻至膜外，利用Annexin V检测能让您作为最快速方便的apoptosis指示：
          ● 只需15分钟，让您快速检测早期apoptosis指示
          ● 无须固定，活细胞即可检测
          ● 可利用Flow cytometry或immunofiuorescence分析结果
          ● 选择性多，可搭配Kit或是抗体

http://s5/mw690/0027k3KGgy72t1wn6NC84&690
http://s11/bmiddle/0027k3KGgy72t1ysxyq3a&690   Tips:
1. 由于凋亡检测的为活细胞,因此整个收集细胞的操作过程尽量保持细胞活性,避免人为的损伤细胞,如:避免用力吹打细胞,避免胰酶消化时间过长,用冰浴的PBS清洗细胞,缩短上机检测的时间。
2. Annexin-V染料上带FITC荧光，因此从染色开始注意避光操作和孵育，一般尽量在染色后半个小时内上机检测。
3. 如果处理的细胞中含有GFP会干扰FITC的荧光信号，应该更换不同波长的荧光染料标记的Annexin-V。
4. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin-V结合，从而干扰实验结果。
5. 在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V 与PS的结合,若胞内已转染GFP，建议使用AnnexinV-PE。
以Annexin V-FITC标示外翻的PS,再合并以PI进行的死亡细胞的染色,以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin V-FITC染成绿色，但对PI拒染；已死亡或Apoptosis后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin V-FITC与PI;健康的细胞则无法染上Annexin
V-FITC或PI		  
产品订购信息：
货号 产品名称 组分/用途 包装
556547▲ FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Annexin V-FITC 100tests
Propidium lodide Staining Solutio
Annexin V Binding Buffer
559763▲ PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Annexin V-PE 100tests
7-AAD
Annexin V Binding Buffer
550911 Annexin V-FITC Fluorescence Microscopy Kit Annexin V-FITC 25tests
Annexin V Binding Buffer
PBS Buffer
550474 APC Annexin V   100tests
556420 FITC Annexin V   100tests
556419 FITC Annexin V   200tests
556454 Annexin V Binding Buffer, 10X Concentrate Binding buffer 50ml
556463▲ Propidium Iodide Staining Solution 碘化丙啶 2ml
559925▲ 7-AAD Staining Solution   2ml
561527 Accutase™ Cell Detachment Solution Accutase消化酶 100ml

Step 2：JC-1 assays/破解线粒体膜电位改变
当细胞凋亡时线粒体膜电位的改变，会导致线粒体膜的通透性改变，使Cytochrome C细胞释放至细胞质中，引发下游酵素反应活化，导致Caspase活化，造成一连串凋亡反应。

● 只需15分钟，可轻松快速染出线粒体膜电位的改变
● 无须固定，活细胞即可检测		   ● 利用Flow cytometry分析结果
● 操作方便， Kit附有详细完整的protocol
JC-1有两种形式：
1、 正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体（Aggregates）存在，FL2 channel可观察到多少红色荧光
2、 细胞走向凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体（Monomer）存在在细胞质，在FL1 channel可以观察到绿色荧光增加。

http://s3/mw690/0027k3KGgy72t1zVBVo02&690
产品订购信息：
货号 产品名称 组分/用途 包装
551302 BD™ MitoScreen (JC-1) 线粒体膜电位检测 100tests

Step 3：Caspase activity assay kits / 检测 Caspase 活化
当Cytochrome C释放至细胞质中，会导致Caspase活化，而活化的Caspase会引发一连串的蛋白质酶解作用（proteolysis cascade）,将凋亡信息送至更下游的物质，造成细胞的特征性型态改变。
  检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性
检测方法：流式 WB IF IHC ELISA等

1、流式检测方法
货号 产品名称 包装 检测方法
550821 PE Rabbit Anti- Active Caspase-3 100tests 流式
559341 FITC Rabbit Anti- Active Caspase-3 100tests 流式
550557 Biotin Rabbit Anti- Active Caspase-3 100tests 流式
550480 FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit 100tests 流式
2 、WB方法
货号 产品名称 包装 检测方法
9664S Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb 100ul WB
9665S Caspase-3 (8G10) Rabbit mAb 100ul WB
3、ELISA方法
货号 产品名称 包装 检测方法
550578 Human Active Caspase-3 ELISA Pair 100tests ELISA
4、其他方法
货号 产品名称 包装 检测方法
K106-100 Caspase-3 Colorimetric Assay Kit 100tests 比色
K105-100 Caspase-3 Fluorometric Assay Kit 100tests 荧光发光
1007-200 Caspase-3 Substrate DEVD-AFC 200tests 底物显色
更多...

Step 4：APO-BrdU&APO-Direct/检测DNAfragmentation现象（TUNEL Assay）
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，形成180-200bp的DNA l片段。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) 或者Brdu，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
http://s2/mw690/0027k3KGgy72t1ATjZTf1&690
流式检测方法：
http://s4/bmiddle/0027k3KGgy72t1BxS7h03&690   http://s14/bmiddle/0027k3KGgy72t1C4kQB6d&690

产品订购信息：
货号 产品名称 规格 检测方法
556381 APO-DIRECT™ Kit （FITC-dUTP） 50tests 一步法流式
556405 APO-BRDU™ Kit （Br-dUTP） 60tests 二步法流式
550803 BrdU In-Situ Detection Kit 50tests 免疫组化
K403-50 ApoBrdU-IHC DNA Fragmentation Assay Kit 50tests 双色免疫组化

上海优宁维生物科技股份有限公司

更多内容你可以通过以下方式联系我们：

电话：4008-168-068
邮箱：info@univ-bio.com

喜欢

0

阅读┊ 收藏 ┊ 喜欢▼ ┊打印┊举报/Report
  

新浪BLOG意见反馈留言板　欢迎批评指正

新浪简介 | About Sina | 广告服务 | 联系我们 | 招聘信息 | 网站律师 | SINA English | 产品答疑

Copyright © 1996 - 2022 SINA Corporation, All Rights Reserved

新浪公司 版权所有