加载中…细胞凋亡步骤介绍详解
(2015-12-21 09:45:50)
标签：
细胞凋亡凋亡步骤详解 |
分类： 实验资料 |
名称：细胞凋亡详细介绍
摘自：优宁维流式网
为程序性细胞死亡，起因可能因为外界环境、生长发育等因素而导致自然死亡现象。当细胞发生apoptosis时，会发生细胞膜PS由内外翻至细胞外、线粒体膜电位改变、Caspase活化。DNAfragmentation,一连串的反应使细胞裂解形成凋亡小体，被巨噬细胞识别并清除。
Step 1：Annexin V binding assay / 细胞膜 PS
外翻
凋亡细胞在早期Phosphatidyl-serine(PS)会由细胞膜内外翻至膜外，利用Annexin
V检测能让您作为最快速方便的apoptosis指示：
以Annexin V-FITC标示外翻的PS,再合并以PI进行的死亡细胞的染色,以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin
V-FITC染成绿色，但对PI拒染；已死亡或Apoptosis后期的细胞因细胞膜已破损会同时染上Annexin
V-FITC与PI;健康的细胞则无法染上Annexin V-FITC或PI。
Tips:
1. 由于凋亡检测的为活细胞,因此整个收集细胞的操作过程尽量保持细胞活性,避免人为的损伤细胞,如:避免用力吹打细胞,避免胰酶消化时间过长,用冰浴的PBS清洗细胞,缩短上机检测的时间。
2.
Annexin-V染料上带FITC荧光，因此从染色开始注意避光操作和孵育，一般尽量在染色后半个小时内上机检测。
3. 如果处理的细胞中含有GFP会干扰FITC的荧光信号，应该更换不同波长的荧光染料标记的Annexin-V。
4.
如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin-V结合，从而干扰实验结果。
5. 在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V
与PS的结合,若胞内已转染GFP，建议使用AnnexinV-PE。
产品订购信息：
| 货号 | 产品名称 | 组分/用途 | 包装 |
| 556547▲ | FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit | Annexin V-FITC | 100tests |
| Propidium lodide Staining Solutio | |||
| Annexin V Binding Buffer | |||
| 559763▲ | PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | Annexin V-PE | 100tests |
| 7-AAD | |||
| Annexin V Binding Buffer | |||
| 550911 | Annexin V-FITC Fluorescence Microscopy Kit | Annexin V-FITC | 25tests |
| Annexin V Binding Buffer | |||
| PBS Buffer | |||
| 550474 | APC Annexin V | |
100tests |
| 556420 | FITC Annexin V | |
100tests |
| 556419 | FITC Annexin V | |
200tests |
| 556454 | Annexin V Binding Buffer, 10X Concentrate | Binding buffer | 50ml |
| 556463▲ | Propidium Iodide Staining Solution | 碘化丙啶 | 2ml |
| 559925▲ | 7-AAD Staining Solution | |
2ml |
| 561527 | Accutase™ Cell Detachment Solution | Accutase消化酶 | 100ml |
Step 2：JC-1
assays/破解线粒体膜电位改变
当细胞凋亡时线粒体膜电位的改变，会导致线粒体膜的通透性改变，使Cytochrome
C细胞释放至细胞质中，引发下游酵素反应活化，导致Caspase活化，造成一连串凋亡反应。
JC-1有两种形式：
1）正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体（Aggregates）存在，FL2
channel可观察到多少红色荧光
2）细胞走向凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体（Monomer）存在在细胞质，在FL1
channel可以观察到绿色荧光增加。
产品订购信息：
| 货号 | 产品名称 | 组分/用途 | 包装 |
| 551302 | BD™ MitoScreen (JC-1) | 线粒体膜电位检测 | 100tests |
Step 3：Caspase activity assay kits / 检测
Caspase 活化
当Cytochrome
C释放至细胞质中，会导致Caspase活化，而活化的Caspase会引发一连串的蛋白质酶解作用（proteolysis
cascade）,将凋亡信息送至更下游的物质，造成细胞的特征性型态改变。
1、流式检测方法
| 货号 | 产品名称 | 包装 | 检测方法 |
| 550821 | PE Rabbit Anti- Active Caspase-3 | 100tests | 流式 |
| 559341 | FITC Rabbit Anti- Active Caspase-3 | 100tests | 流式 |
| 550557 | Biotin Rabbit Anti- Active Caspase-3 | 100tests | 流式 |
| 550480 | FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit | 100tests | 流式 |
2 、WB方法
| 货号 | 产品名称 | 包装 | 检测方法 |
| 9664S | Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 100ul | WB |
| 9665S | Caspase-3 (8G10) Rabbit mAb | 100ul | WB |
3、ELISA方法
| 货号 | 产品名称 | 包装 | 检测方法 |
| 550578 | Human Active Caspase-3 ELISA Pair | 100tests | ELISA |
4、其他方法
| 货号 | 产品名称 | 包装 | 检测方法 |
| K106-100 | Caspase-3 Colorimetric Assay Kit | 100tests | 比色 |
| K105-100 | Caspase-3 Fluorometric Assay Kit | 100tests | 荧光发光 |
| 1007-200 | Caspase-3 Substrate DEVD-AFC | 200tests | 底物显色 |
| 更多... | |||
Step
4：APO-BrdU&APO-Direct/检测DNAfragmentation现象（TUNEL
Assay）
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，形成180-200bp的DNA
l片段。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP)
或者Brdu，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End
Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。
流式检测方法：
产品订购信息：
| 货号 | 产品名称 | 规格 | 检测方法 |
| 556381 | APO-DIRECT™ Kit （FITC-dUTP） | 50tests | 一步法流式 |
| 556405 | APO-BRDU™ Kit （Br-dUTP） | 60tests | 二步法流式 |
| 550803 | BrdU In-Situ Detection Kit | 50tests | 免疫组化 |
| K403-50 | ApoBrdU-IHC DNA Fragmentation Assay Kit | 50tests | 双色免疫组化 |
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免费热线：4008-168-068
联系方式：021-38015269/89
咨询邮箱：info@univ-bio.com
公司网站：www.univ-bio.com
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