胞内细胞因子流式检测：常见问题解答

 上海优宁维生物科技有限公司

1、在进行胞内因子染色时,BD Fc Block™试剂有多重要?该如何应用?

   Fc 受体的应用时非常必要的,尤其是用于单核细胞或粒细胞。BD FcBlock 应在固定破膜之前使用。目前 BD 可提供针对小鼠（货号 553141 或 553142）和大鼠（货号 550270 或 550271）的 BD Fc Block 产品。而对于人类细胞的胞内染色，Fc受体的阻断并不是特别重要。特定情况下检测人类样本时，可以应用常规的阻断剂如相同物种的不相关纯化 Ig，或染色抗体来源物种的血清。

 

2、胞内细胞因子染色时阻断步骤需要加入的重组细胞因子的量是多少？

  每 0.50 μg 抗体通常加入 0.25μg 细胞因子。

 

3、对于胞内因子染色的优化需要注意哪些？

  为了简化流式检测胞内细胞因子的操作步骤，降低非特异性反应的可能性，推荐使用直接标记荧光染料的抗体。不建议使用生物素结合的抗体（随后与链霉素结合的荧光染料反应）。

 

4、对于大鼠细胞的因子检测，有没有推荐的刺激方法？

  由于大鼠细胞在培养 2-5 天之后缺乏生存能力，细胞因子的刺激非常困难。内部检测时，通常只能得到 30-60%的存活率。如下提示可保证细胞存活率：以全淋巴结细胞代替 CD4 细胞。

  与重组的 IL-2 和 IL-4 共孵育时，在第二天观察一下培养液。如果细胞已长满，一分二之后换取含有重组 IL-2 和 IL-4 的新鲜培养液。也可以在两天后停止培养，用 PMA 和离子霉素刺激。培养两天会使细胞因子分泌更少，但是细胞活性更好。
 

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5、同时检测胞内因子 IFN-γ, IL-4, IL-17A 和 FoxP3 时是否有推荐的 buffer？

  除了 IL-4，FoxP3 与以上其他细胞因子同时检测时推荐使用 FoxP3buffer（ 转录因子 buffer 亦可，货号562574）。目前为止，同时检测 FoxP3 与 IL-4 尚未成功，但 IL-17A 与 IFN-y 染色良好。

 

6、抗-小鼠 IL-17 抗体（clone TC11-18H10）识别 A 亚型还是 F 亚型？
  此克隆抗体识别 IL-17A 亚型因子

 

7、检测人 IL-17A 时需要用 EL4 细胞的哪种 ATCC 菌株？
   用到的 EL4 细胞类型为 ATCC TIB-39。

 

8、一步检测 IL-17A 和 Tregs 是否有推荐的试剂？
 BD 有同时检测 Tregs 和 Th17 的混合试剂，相应人的产品货号为 560767，小鼠产品货号为 560752。详细操作及包含试剂请参见网站说明书。

9、是否可一步检测 Th1/Th2/Th17 分泌细胞？如果可以，有哪些推荐的试剂？

   有。我们可用 Th1/Th2/Th17phenotyping kits（人的产品货号：560751；小鼠产品货号：560758）检测 Th1/Th2/Th17 分泌型细胞。详细信息可参见网站说明书。对于 Th1/Th2/Th17 细胞因子的定量检测，推荐使用BD Cytometric Bead Array（CBA 技术）。相应产品货号为 560484（人）和 560485（小鼠）。

 

10、如何在体外用人的 PBMCs 得到 Th9 极化细胞？

   要在体外得到 Th9 细胞：

   用板包被的 CD3 抗体 (10 μg/mL) (Cat. No. 555329)和 CD28 抗体 (1 μg/mL) (Cat. No.555725) 外加重组 IL-2 (10 ng/mL)(Cat. No. 554603)，IL-4 (50 ng/mL) (Cat.No. 554605)，TGF−b (10 ng/mL) (Cat.No. 356039)及anti–IFN-y (10 μg/mL)(Cat. No. 554698) 刺激 PBMCs 五天。

 收集细胞，在 BD GolgiStop蛋白转运抑制剂存在条件下，用 PMA(50 ng/mL)和离子霉素(1 μg/mL)重复刺激。

 收集细胞，用 BDCytofix/Cytoperm试剂固定破膜后抗体染色（克隆号：MH9A3）

11、我想要用 BD 抗人-GATA3 抗体（克隆：L50-823）与 IFN-y 和 IL-4 共染，推荐的 buffer 是什么？

    流式检测 GATA3 需要破膜。已证实 GATA3 与胞内因子共染时，使用 BDCytofix/Cytoperm fixation/permeabilization solution and BD Perm/Wash buffer (货号：554714) 可得到很好的结果。

 

12、为什么胞内因子检测（ICS）与 ELISA 之间相关性不好？

    ELISA 结果与流式检测的阳性细胞百分比之间很难直接关联在一起。因为 ELISA 检测的是已释放较长时间的细胞因子含量（有时是数天），而流式胞内因子检测的是细胞刺激之后的及时反映。因此，很可能少量的阳性细胞在一段时间之后会分泌大量的细胞因子于培养上清中，导致 ELISA 的结果与胞内因子染色的结果不一致。
 

13、BD提供的三种不同的胞内因子检测试剂盒（554714，554715 和 555028）之间主要差异是什么？

货号554714  BD Cytofix/Cytoperm™Fixation/Permeabilization Solution Kit

货号554715  BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/PermeabilizationSolution Kit with BD GolgiStop

货号555028  BD Cytofix/Cytoperm™Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug

三者之间的主要差异是所含的细胞因子转运抑制剂不同。554714 不含蛋白转运抑制剂，只有固定破膜剂 BD Cytofix/Cytoperm™ fixation/permeabilization solution。554715 同时包含蛋白转运抑制剂莫奈霉素和固定破剂。555028 包含蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素A（BFA）和细胞固定破膜剂。

 

14、BDPerm/Wash buffer 中的沉淀是什么？会对结果产生影响吗？

BD Perm/Wash buffer 中少量沉淀是正常的。此沉淀来源于溶液中的皂角苷，对实验结果没有任何影响，因为在少量皂角苷存在时破膜仍然有效。你也可利用 0.45μm 的滤器将沉淀过滤掉，但这并不是必要操作。

 
15、在进行 BD Cytofix/Cytoperm 细胞因子染色步骤时，最佳的终止点是什么？

流式胞内因子检测时，如果需要终止实验，建议在细胞固定后进行。固定后彻底清洗细胞以确保洗掉所有的固定液。随后细胞可在染色液中 4°C 保存数天，有时几个月。我们曾在细胞固定，4°C 保存 4-6个月后再进行 CD4 染色，仍可得到较好的结果。但是长时间储存之后的结果好坏取决于抗原及使用的抗体类型。

 
16、BD GolgiStop™ and BD GolgiPlug™蛋白转运抑制剂的区别是什么？

这两种抑制剂的主要区别是在胞内作用的部位不同。BDGolgiStop（莫奈霉素）作用于蛋白在内质网（ER）的积累阶段,而 BD GolgiPlug（BFA）作用于蛋白在高尔基体的累积阶段。抑制剂的使用会提高流式检测细胞因子分泌细胞的能力。
 

17、BDGolgiStop（莫奈霉素）的储存浓度时多少？

BD GolgiStop（莫奈霉素）的储存浓度为 3m M，溶剂为乙醇。

18、BDGolgiPlug（BFA）的储存浓度是多少？

BD GolgiPlug（BFA）以 1mg/ml 的浓度溶于 DMSO，2–8°C 时会结晶形成固体。

 

19、检测人 Th1/Th2 细胞的胞内因子分泌时，需要用到哪些抗体？

  人 Th1/Th2 胞内因子检测时需要用到的抗体有：

  Th1: INF-γ, clone: B27, optional IL-2,clone: MQ1-17H12;

  Th2: IL-4, clone: MP4-25D2, optional IL-5,clone: TRFK5

  计算特定细胞群中 Th1 阳性细胞与 Th2 阳性细胞比率的最好方法就是流式细胞术。ELISA是定量检测，只能提供某种特定细胞因子的阳性结果，并不能得出 Th1 及 Th2 细胞的比例。而使用流式细胞术即可鉴定 Th1 及 Th2 阳性的细胞亚型。

 

20、流式检测胞内因子染色时，哪种抗人-IFN-y 克隆效果较好？中和反应中哪种克隆结果最好？

    胞内染色时克隆号 B27 和 4S.B3 的抗人- IFN-y 结果都很好。而对于中和反应，B27 比 4S.B3 稍好。

 

21、为什么无法得到大量的 IL-5+小鼠脾细胞？

 小鼠细胞产生的 IL-5 水平非常低，推荐的刺激步骤为：

   从 BALB/c 或 C57BL/6 小鼠中分离 CD4+脾细胞，然后用固体化抗小鼠-CD3 抗体（145–2C11, 包被板浓度：25 μg/mL，货号：553057），可溶性抗小鼠-CD28（37.51, 2 μg/mL, 货号：553294）以及重组小鼠IL-2（10 ng/mL,货号：550069）和重组小鼠 IL-4（50 ng/mL, 货号：550067）刺激 2 天。清洗细胞，随后用含有 IL-2 和 IL-4 的培养基培养 3 天，以促进细胞增殖与分化。最后收集细胞，在蛋白转运抑制剂存在条件下用固体化抗小鼠-CD3（包被板浓度：25 μg/mL）和抗小鼠-CD28（2 μg/mL）重复刺激细胞4-6 小时。细胞也可用 PMA（5 ng/mL; Sigma, 货号：P–8139）和离子霉素（500 ng/mL; Sigma, 货号：I-0634）重复刺激 4-6 小时(提前加入蛋白转运抑制剂)。

   在 PMA 和离子霉素刺激后，建议先用记忆性 T 细胞的表面标记（例如 CD44 或 CD62L）做染色，随后再做胞内标记。收集 5000 到 10000 个 CD44+或 CD62L+记忆性 T 细胞并对此群细胞设门会帮助检测 IL-5+细胞。

 

22、肝素锂抗凝的血样本与 BD FastImmune™实验操作兼容吗？

   BD生物科学部门应用于“淋巴细胞的细胞因子检测”和“单核细胞的细胞因子检测”的使用说明书注明只能使用肝素钠。但是从外部使用者得到的反馈显示肝素锂抗凝的全血也可用于BD FastImmune 操作中。但是内部并未证实使用肝素锂与肝素钠的效果差异。

 

23、BD抗-TNF 抗体是专门针对 TNF-α 吗？

   不久前BD更新了 TNF 产品的统一命名，以反映命名方式的变化。最早在文献中提及 TNF 时，发现有两种相关蛋白：TNF-a 和 TNF-B，各自发挥不同的功能。随着研究的进展，两种蛋白逐渐被分离且发现二者之间并没有联系。而被定义为 TNF-B 的蛋白实际上与淋巴毒素 a（LT-a）相同。所以 TNF-a变成了 TNF，TNF-B 目前被称为 LT-a。因此目前有两种 LT 蛋白：LT-a (即 TNF-B) 和 LT-B。

 

24、流式可区分受体结合型、可溶性及跨膜的 TNF 吗？

   利用脱酸步骤可将跨膜 TNF 与膜上 TNF 受体结合的 TNF 区分开来。在此类试验中，用酸性溶液处理细胞使之释放受体结合的细胞因子，同时跨膜的细胞因子在原位保持不动。

 

25、如何用 IL-17A ELISA 抗体对（货号：555068 和 555067）进行 ELISA 实验？

   用小鼠 IL-17A 的 ELISA 试剂（货号：555068 和 555067）进行实验时，推荐使用 0.1M 钠磷酸盐 pH9.0作为包被溶液，R&D Systems 重组 小鼠 IL-17A（货号：421-ML）作为标准品。详细信息请参见细胞因子 ELISA 操作说明：bdbiosciences.com/support/resources/elisa_elispot/index.jsp

 

26、BrdU与胞内细胞因子可以同时检测吗？

   可以。建议同时使用所有的抗体，并与细胞共同孵育。我们发现，无论预先加入 BrdU 还是胞内因子的抗体，清洗后加入另一种抗体都无法标记细胞。如果打算同时进行 BrdU 和胞内因子染色，可以使用 BrdU 流式检测试剂盒。试剂盒的更多详细信息请参见说明书：bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/manuals/live/web_enabled/03-8100055-1C.pdf

 

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