加载中…揭秘细胞培养中出现的“亮点”
(2011-11-23 23:13:51)
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杂谈 |
分类： 专业 |
也许各位战友都遇到过：细胞株细胞传代多了以后，经常出现一种现象——亮点。
这种“亮点”，不是污染，但消化后又可以贴壁，很难消除。出现之后，短时间内，细胞或许影响不大，但时间长了，亮点越聚越多，就会影响细胞生长，尤其会影响爬片的细胞状态和后续各类染色的观察。“亮点”增多的同时，往往异型化的细胞增多，缓慢生长的细胞增多，难消化的细胞增多。
写本文前搜索了一下论坛以前的帖子，发现很多细胞培养都遇到这种“亮点”，但都没有对其提出比较明确的区分和解决办法。说实话，我也不太明白它到底是什么，其产生的决定性因素是什么，又该如何根治。不过，养细胞这么多年，也遇到过它，并积累了一些经验，现分享出来，作为引玉之砖，欢迎大家讨论。
“亮点”，是什么样的呢？
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/45/21568737.jpg
上面图中红色圈中的，就是“亮点”。(p.s. 这张是HUVEC，本来考虑下文，应该用HBZY-1的，结果处理之前忘了拍片，大家凑和看一下吧，样子一样的)
“亮点”在镜下看就是一个亮点，中央略暗，可能出现在细胞间隙，也可能在细胞中，贴壁，结构不清晰，但边界较清楚。
从形态和位置看，“亮点”应该是细胞死亡或者凋亡产生，与细胞培养过程中细胞过密、消化过度、吹打太剧烈等有关，甚至二氧化碳浓度、pH值也可能有关。
到底是什么，怎样产生的，还请大家补充和纠正。
重点是，“亮点”，如果清除呢？我有办法。
具体做法是，先用冷(4度)PBS荡洗细胞2-3次，以充分洗掉血清和上清中可能的漂浮物
→低浓度(0.125%)冷(4度)胰酶消化，轻轻晃动细胞瓶，同时镜下观察，时间自己掌握，以正常细胞开始变圆变亮为度。
我以HBZY-1为例(刚好有实习生养坏了的一瓶细胞)，下图显示消化过程中，不少“亮点”(红色圈内)和状态稍差、贴壁不牢的细胞(黄色圈内)被消化下来，漂浮在上清中。而图中此时下面的大量细胞都刚刚开始有消化的迹象，为避免处理过度，我到此为止了。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/22/17900073.jpg
→ 冷PBS反复荡洗，直至瓶中再无消化下来的“亮点”和细胞。
→ 继续用冷胰酶(恢复到正常消化浓度0.25%)消化细胞。
下图为此时消化中的HBZY-1细胞。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/26/97714528.jpg
→ 倒掉胰酶，加上培养基，轻轻吹打，每个区域一次就够。低速离心5分钟。
下图为吹打过后，残留状态不好的细胞和顽固“亮点”。图中小黑点为细胞碎片。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/36/80050992.jpg
→ 然后根据细胞数量，传代。
这种“亮点”，不是污染，但消化后又可以贴壁，很难消除。出现之后，短时间内，细胞或许影响不大，但时间长了，亮点越聚越多，就会影响细胞生长，尤其会影响爬片的细胞状态和后续各类染色的观察。“亮点”增多的同时，往往异型化的细胞增多，缓慢生长的细胞增多，难消化的细胞增多。
写本文前搜索了一下论坛以前的帖子，发现很多细胞培养都遇到这种“亮点”，但都没有对其提出比较明确的区分和解决办法。说实话，我也不太明白它到底是什么，其产生的决定性因素是什么，又该如何根治。不过，养细胞这么多年，也遇到过它，并积累了一些经验，现分享出来，作为引玉之砖，欢迎大家讨论。
“亮点”，是什么样的呢？
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/45/21568737.jpg
上面图中红色圈中的，就是“亮点”。(p.s. 这张是HUVEC，本来考虑下文，应该用HBZY-1的，结果处理之前忘了拍片，大家凑和看一下吧，样子一样的)
“亮点”在镜下看就是一个亮点，中央略暗，可能出现在细胞间隙，也可能在细胞中，贴壁，结构不清晰，但边界较清楚。
从形态和位置看，“亮点”应该是细胞死亡或者凋亡产生，与细胞培养过程中细胞过密、消化过度、吹打太剧烈等有关，甚至二氧化碳浓度、pH值也可能有关。
到底是什么，怎样产生的，还请大家补充和纠正。
重点是，“亮点”，如果清除呢？我有办法。
具体做法是，先用冷(4度)PBS荡洗细胞2-3次，以充分洗掉血清和上清中可能的漂浮物
→低浓度(0.125%)冷(4度)胰酶消化，轻轻晃动细胞瓶，同时镜下观察，时间自己掌握，以正常细胞开始变圆变亮为度。
我以HBZY-1为例(刚好有实习生养坏了的一瓶细胞)，下图显示消化过程中，不少“亮点”(红色圈内)和状态稍差、贴壁不牢的细胞(黄色圈内)被消化下来，漂浮在上清中。而图中此时下面的大量细胞都刚刚开始有消化的迹象，为避免处理过度，我到此为止了。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/22/17900073.jpg
→ 冷PBS反复荡洗，直至瓶中再无消化下来的“亮点”和细胞。
→ 继续用冷胰酶(恢复到正常消化浓度0.25%)消化细胞。
下图为此时消化中的HBZY-1细胞。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/26/97714528.jpg
→ 倒掉胰酶，加上培养基，轻轻吹打，每个区域一次就够。低速离心5分钟。
下图为吹打过后，残留状态不好的细胞和顽固“亮点”。图中小黑点为细胞碎片。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/36/80050992.jpg
→ 然后根据细胞数量，传代。
→
4到8小时后，取出刚传代的细胞，镜下观察，如有细胞贴壁，立即换液，把现在还没贴壁的通通丢掉。
下图中为贴壁6小时后的HBZY-1，部分“亮点”未贴壁。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/39/46268670.jpg
下图为换液后，“亮点”少了很多。（还有细胞碎片未除掉，不是本贴关注内容，不讨论）
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/40/60041286.jpg
多做几次这样的操作，“亮点”，也许仍无法根除，但至少，再也不会满视野亮晶晶，而染色好的细胞爬片中，再也不会出现“找不到一个细胞干干净净的视野”的情况出现。
下图中为贴壁6小时后的HBZY-1，部分“亮点”未贴壁。
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/39/46268670.jpg
下图为换液后，“亮点”少了很多。（还有细胞碎片未除掉，不是本贴关注内容，不讨论）
http://img.dxycdn.com/upload/2011/05/20/40/60041286.jpg
多做几次这样的操作，“亮点”，也许仍无法根除，但至少，再也不会满视野亮晶晶，而染色好的细胞爬片中，再也不会出现“找不到一个细胞干干净净的视野”的情况出现。
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