包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。

（一）试剂配制

1、缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100mM NaCl。

2、缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40。

3、缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100（V/V），4M脲素。

4、缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，3% Triton X-100 。

5、缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100，2M 盐酸胍。

6、缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。

（二）操作步骤

1. 用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）， 离心6000g×15min,收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。

2. 将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min,收集包涵体沉淀。

3. 将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。

4. 包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。

5. 溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。

包涵体蛋白的纯化和复性

1．菌体的收集和破碎

用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）

重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。破碎后的匀浆， 4℃、 12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

2．包涵体的处理

洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）

2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）

3．目的蛋白的纯化

    亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。

    谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

    另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性或弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点：首先，由于只有6个组氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能够保持结合力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点，但此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。

融合蛋白的表达和纯化过程：

1.挑单菌落于3-5 ml 2YT或LB 培养中，37℃过夜培养。

2.按1：100的比例取过夜培养液转接。37℃扩大培养至OD 0.5左右。

3.加入IPTG终浓度0.2～0.4 mM/L。 37℃摇床培养4～6h。

4.12000g离心15min，去上清。按40ml/100ml菌液加入1×Binding Buffer {破碎缓冲液组成： 50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，溶菌酶(10 礸/g cell)，；或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 礸/g cell) }细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。或4×PBS重悬细胞。

5.超声波破碎：占空比50％，超声15s，停15s，10～20min。破碎后的匀浆在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

6.洗涤包涵体：2M尿素在50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，10% Triton X-100中洗涤。洗涤2～4h 去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，10% TritonX-100，二硫键还原剂中洗涤。洗涤4～8h，使包涵体变性可溶。

7. 过Ni柱：

Ni^2＋亲和层析柱纯化

    包涵体溶解后的上清液，用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni^2＋沉淀；5×柱体积的Charge Buffer充电；20×柱体积的三蒸水洗涤，去尽游离的Ni^2＋；10×柱体积的Binding Buffer平衡柱子；手工上样，根据蛋白的浓度来确定上样体积；20×柱体积的Binding Buffer洗涤，至检出无蛋白，并收集流出液，用于12％SDS-PAGE电泳检测；6×柱体积的Wash Buffer洗涤，至检出无蛋白；Elution Buffer洗脱，每次1 mL，收集洗脱流出液，洗脱至检出无蛋白；10×柱体积的Binding Buffer平衡。此时，即可用于纯化同种蛋白，不需重新充电。

    纯化操作完成后，加5×柱体积的Strip Buffer洗涤，去尽Ni^2＋；10×柱体积的三蒸水洗涤去尽EDTA；加5×柱体积的0.5 mol/L NaOH，静置0.5-2 h，去沉淀的蛋白质；三蒸水洗涤，至流出液的pH值为7.0；20％乙醇洗涤，再加适量20％乙醇，于4℃保存。

A、过柱前的注意事项：

a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；

b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；

c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；

B、过Ni柱的操作步骤：

①用DDW洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；

②⑩5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO₄）充电；

③5×柱体积的DDW洗涤，去游离的Ni离子；

④10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；

⑤上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；

⑥10×柱体积的Binding Buffer洗涤，至无蛋白检出，用三氯醋酸检测，收集流出液；

⑦Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；

⑧10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。

⑨用20％的乙醇充满柱子，保存在4℃。

注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。

C、柱的清洗与保存（最好每天清洗一次）：

（1）去Ni离子：

①5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；

②10×柱体积的DDW洗涤。

（2）去沉淀的蛋白质：

①5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；

②DDW洗涤，至流出液的pH值为7。

（3）保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。

D、柱的再生：

当流速很慢、充电后基质不变成蓝绿色时，应进行柱的再生。

① 2×柱体积的6M盐酸胍洗涤，然后3×柱体积的DDW洗涤；

② 1×柱体积的2％SDS洗涤；

③ 5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；

④ 5×柱体积的DDW洗涤，然后5×柱体积的100mM EDTA，pH8.0洗涤；

⑤ 3×柱体积的DDW洗涤，然后3×柱体积的20％乙醇洗涤；

⑥ 20％乙醇保存于4℃。

【备注】Ni²⁺亲和层析柱纯化缓冲液（1×Buffer）：

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