生物样品分析：对来自动物或临床的生物样本中的药物、代谢物、生物标志物进行分析。方法学考察：专属性、线性、最低定量限、回收率、稀释完整性（必要时）、基质效应、稳定性等。

一、来自审评员的困惑：同一企业药品的AUC均值相差数倍。

二、原因：标准品纯度有误或未加校正、配制的母液浓度错误、天平或容器计量不准、使用与测试基质不同的空白生物样品基质（如临床上用的成份血浆）、线性和质控样配制不规范等。

三、数据不准确造成的问题：误导，甚至导致本可上市的药物被拒批。例：浓度依赖性抗菌药物若AUC测定不准确则不能正确地通过AUC/MIC比值来确定最佳给药剂量；3类化药的PK桥接研究在没有国外人群作为参比的情况下，若测定结果不准确则不易正确判断种族差异。

四、如何避免

（一）策略

1.参照药物临床试验生物样本分析实验室管理指南（试行）的要求改进不足；独立运行的质保体系。

2.多方对比所获数据（如与原研企业、文献、本单位以往获得的结果对比），分析产生差异的原因并克服。

3.测试人员相对固定，新人需经过培训、能力测试等。

4.样品采集与测试不在一地进行或样品转移时间较长时，应保证样品在转移过程中稳定并用数据说明。

5.样品分析跨度时间较长或多个相关试验同时或先后进行时，应保证不同时间、地点试验结果的一致性。一般不频繁更换测试单位，确实需更换时进行实验室比对试验（样品互测）。使用不同测定方法时建议交叉验证。

6.承担测试的试验单位应确保当试验数据与申办者利益出现冲突时处在公正立场，杜绝造假。

（二）提高研究数据质量的经验介绍

1.仪器状态：多数需计量认证，必要时3Q认证（IQ/OQ/PQ）。

2.对照品（标准品）：首选国家对照品（标准品）；从试剂公司购买、自制的对照品要保证批次间的一致性并提供CoA；一般不用自身制剂作为对照品。计算时注意是否需扣除盐基、水份。开封后尽快使用，避免吸潮和分解。周期较长的临床试验，对照品的批次不要更换太频繁。

3.计量容器：定期校准、专人专用，开展新试验时可全部重新校准。称量时要考虑天平的感量，10mg以上用万分之一天平，1mg用百万分之一天平。

4.考核用的生物基质应与样品基质的来源和含量一致：成份血、动物血不能用来代替临床受试者的血样进行方法学考察；血清和血浆不能互相替代；不能用稀释后的血浆代替正常人血浆。不同来源血浆（清）的专属性、基质效应等考察中要标明来源。

5.线性和质控样配制规范化：模拟样和待测样的基质种类及含量严格一致。目前制备模拟样的主要方法：

⑴将一定体积的工作液加入到生物基质中→稀释以获得不同浓度的模拟样→等份。缺点：使用空白生物基质较多。注意：加入溶剂的体积比例。第一个点一般在5%以下。过多的溶剂（如甲醇）可使蛋白变性，造成药物被吸附或包裹，使整个浓度范围出现误差。

⑵将贮备液稀释成不同浓度的工作液→临用时取同样体积的工作液加入到生物基质中制备成不同浓度的线性和质控模拟样，没有等份。优点：较节省空白生物基质。缺点：现用现配时待测物溶液中的成份和血浆（清）之间可能未达到平衡即进入下一步处理，造成回收率结果虚高。注意：①进行生物样品稳定性考察时要考虑终体积和溶剂比例。如样品处理时使用100ml血浆，则最好用等份的100ml血浆质控来进行模拟。②严格平行操作（临床样品需补充同体积溶剂）。③注意贮备液的稳定性。

⑶将不同浓度的工作液加入到试管中→吹干→加入固定体积的生物基质→振摇使残渣溶解。优点：较节省空白生物基质。缺点：吹干过程可能造成待测物损失，残渣也可能溶解不彻底。注意：贮备液的稳定性。

⑷将贮备液稀释成不同浓度的工作液→取同样体积的工作液加入到同样体积的生物基质中制备成不同浓度的模拟样→等份。优点：较规范。缺点：使用空白生物基质较多。注意：控制溶剂含量在5%以内。

注意：加入质控样是为了保证方法的可靠性。目前的指导原则只推荐由不同人制备，从提高数据质量的角度应由不同人从称量开始进行质控样配制（包括LLOQ样）。质控样的浓度尽量与线性样区别。配制的质控浓度：QCL应在3倍LLOQ浓度内，QCM应在线性范围的几何或算术平均值的40~60%，QCH应为线性上限的75~90%。质控样一次配制可适当多些，不同批次的质控样有时还需在一个分析批内测定以比较浓度是否有明显差异。

6.内标和最低定量限：内标的浓度要兼顾待测物的含量，太高则峰面积比值很小，易受有效数字影响，太低则易受基线噪音影响，应保证S/N>20；专属性考察时不同来源生物样品的干扰峰面积应小于LLOQ样峰面积的20%；交叉干扰峰面积应小于LLOQ样峰面积的20%或保证S/N35；确定最低定量限时应对S/N留有一定的冗余度，以便仪器灵敏度下降后其S/N值还能符合要求；选择内标时，液质联用方法推荐选择高纯度的稳定同位素标记的内标。

7.系统适应性和研究者能力考核：推荐每批分析前使用不同的样品溶液（如不含生物基质的LLOQ溶液、LLOQ、ULOQ、空白样）进行系统适用性试验，主要考核仪器灵敏度、分离度、峰形、信噪比、噪音水平、交叉污染情况等；对参与样品分析的研究者进行研究能力考核。

8.转移样品的稳定性：生物样品在常温下有些成分会迅速降解，导致测试数据失真。质保措施外+数据说明。

9.分析批序列：进样之间的交叉污染是评价分析批质量的关键因素之一，应作为方法学考察指标。可在分析批运行前和运行中考核。将不同浓度的质控样品交叉进样，比较各质控浓度点测试的准确度和精密度。必要时在方法学中进行残留试验（在线性高浓度点进样后接着进一个空白样，根据空白样图谱中残留的大小确定所建方法的交叉污染是否合适）。

10.样品复测：质控样重复测定的一致性往往并不代表实际样品测定结果的一致性。

11.测试部分安排在几个单位进行时，应进行分析方法转移后的再现考核，必要时进行实验室间比对试验。

12.交叉考核：涉及两种或以上测试方法时进行交叉考核。

13.样品采集：试验过程规范（尽量避免采血前受试者刚用完餐或大量饮水）、采样时间准确、留置针采样时去除残留血样的污染、血浆或血清离心及时、无溶血、避光操作、获得的生物样品及时冻存、对尿液涉及时间段和体积记录准确、留样前混合均匀、长时间段的尿样冷藏保存等。

14.实验室之间考核：一定时期内参加权威机构的盲样测试（目前国内还缺乏此类机构）。

原文链接：http://www.cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage&id=312642