目的基因与载体的连接在2008年海南高考生物试题和2010年江苏高考生物试题中均有所体现，由于考察的点不同引起了很多老师的讨论和思考。而目的基因与载体的连接方式多样，会由于所用的限制性内切酶的不同和DNA连接酶的不同而有所不同。

26．（2008年海南高考）（18分）（选修模块3：现代生物科技专题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tct^R为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶且位点。

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有               、              、

                    三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行            。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是          ；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是            。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是       ，其合成的产物是      。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是                      。

答案：（1）目的基因-载体连接物  载体-载体连接物  目的基因-目的基因连接物  分离纯化  （2）载体-载体连接物  目的基因-载体连接物、载体-载体连接物  （3）启动子  mRNA

（4）EcoRⅠ和BamHⅠ

27．（2010年江苏高考）（8分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

（1）一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有 ▲ 个游离的磷酸基团。

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越 ▲ 。

（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是 ▲ 。

（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 ▲ 。

（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 ▲ 酶。

（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 ▲ 。

（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 ▲ 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

[答案] 27．（8分）

（1）0、2

（2）高

（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因

（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化

（5） DNA连接

（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞

（7）蔗糖为唯一含碳营养物质

一、各种连接情况分析

1、载体和外源DNA插入片段的连接结果

2、同种限制性内切酶和不同限制性内切酶但产生同尾粘性末端的连接

不能确定方向。

3、两种不同的限制性内切酶产生的粘性末端的连接方式

 二、防止载体自身环化连接的方法

1、提高插入片断的用量

连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。

2、用碱性磷酸酶处理载体

载体切口的 5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。

3、用双酶切形成不同的粘性末端。

三、提高重组率的方法：

1、连接反应条件

       外源片段：载体＝5:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。

2、载体除磷（磷酸酯酶5’除磷）

 3、 防止载体自我环化

由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接