应用介绍

SeqCap® EZ富集(SeqCap® EZ Enrichment)

SureSelect®富集(SureSelect® Enrichment)

外显子组富集(Exome Enrichment)

福尔马林固定石蜡包埋DNA-测序(FFPE DNA-seq)

DNA-测序(DNA-seq)

胚胎植入前遗传学筛查与诊断 (PGS/PGD)

RNA-测序(RNA-seq)

染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)

 1.       SeqCap® EZ富集(SeqCap® EZ Enrichment)

使用罗氏的Roche NimbleGen^® SeqCap®EZ平台富集ThruPLEX^®文库，操作十分简单，下图为所需的所有试剂。

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2         SureSelect®富集(SureSelect® Enrichment)

使用安捷伦SureSelect^®平台富集ThruPLEX^®文库，操作十分简单，下图详细列出所需试剂。

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3. 外显子组富集(Exome Enrichment)

介绍

为了分离和测序感兴趣的基因序列，富集是样品制备的一种重要的策略，可降低成本，提高生物信息学分析效率。在外显子组富集中，感兴趣的基因是人类基因组中的外显子组，这部分序列只占人类基因组序列中的1%，30 Mb。在典型的外显子组测序流程中，文库由纯化的DNA构建，通过使用寡核苷酸探针在溶液中杂交的方法予以富集，进而测序。

现在有好几家公司能提供用于分析外显子组的试剂盒，包括从血浆，新鲜组织和FFPE来源的样品中制作文库。这些试剂盒包括设计用于杂交捕获感兴趣基因（此处即指整个外显子组）的寡核苷酸探针。这些试剂盒由安捷伦和罗氏提供，其它还包括IDT订制系列(custom panels)用于捕获相应“panel”的基因。

虽然有几个厂家提供了出色的富集工具，对于含量低的样品而言，这些产品所生成的文库质量都不理想。ThruPLEX试剂盒可以使用比上述产品低得多的DNA初始量，制备出至少是与上述产品相同量的文库来。在应用说明中，我们证明用ThruPLEX试剂盒制备的文库可以和安捷伦的SureSelect技术兼容，而所获的结果优于安捷伦的SureSelect文库制备试剂盒。

工作流程

使用ThruPLEX的标准流程进行。如果是多重(multiplexing)测序，每个文库必须生成相一致的barcodes。文库合并，添加xGen®通用封闭寡核苷酸(xGen® Universal Blocking Oligos)(Integrated DNA Technologies)抑制(文库片段彼此相结合所致)菊链(daisy-chaining)形成。这一样品然后用于富集。

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 xGen®通用封闭寡核苷酸(xGen® Universal Blocking Oligos)信息

所有的封闭寡核苷酸探针都可以在IDT (Integrated DNA Technologies)公司获得。当使用8 nt单或双indexes ThruPLEX DNA-测序试剂盒时，订购xGen® Universal Blocking Oligo – TS HT-i5和xGen® Universal Blocking Oligo – TS HT-i7

 详情见各自相应说明书

Exome Capture of ThruPLEX® Libraries with Roche NimbleGen® SeqCap® Library

Exome Capture of ThruPLEX® Libraries with Agilent SureSelect® Capture Library

4. 福尔马林固定石蜡包埋DNA-测序(FFPE DNA-seq)

介绍

福尔马林固定石蜡包埋的组织多是收集、保存组织，供病理医师和研究者用于形态学研究用的。福尔马林固定使核酸和蛋白在细胞内交联，再通过石蜡封闭可以让组织在室温下保存多年。如今文库制备和新一代测序技术的进展，使这种保存形式下的核酸也能测序，提供重要的基因组学信息。正基于此，存档FFPE组织样品已成为丰富、宝贵的基因研究材料。实验室正越来越多的使用FFPE样品确定疾病相关基因，突变和生物标志物。全球Biobanks中拥有数以千万记的存档样本。

工作流程

典型的工作流程如下：基因组DNA首先从FFPE样中分离，然后通过机械力将其切割生成短的双链分子。因为保存的原因，通常DNA的量较低且处于受损状态。因此，为了产生高质量的文库并保证高质量的测序结果，文库预备的方法至关重要。多个顶级实验室选择了ThruPLEX®技术构建FFPE样品文库，因为其为单管流程，对受损DNA呈现的效果好，使用低的上样DNA量即可获取好的扩增效率。ThruPLEX®技术高效，精确而且不需要纯化步骤，减少了由此带来的损失。最重要的是，其专利的DNA修复和连接反应让存档FFPE样中高度降解的DNA能获取敏感、一致的测序结果。

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技术

第一步 ThruPLEX技术的修复反应性能卓越，确保FFPE样品处在优良的连接预备状态

第二步 高效平端连接，降低了引物二聚体的形成和相应背景值，因为发夹接头阻止了5’末端，且不存在单链尾端

第三步 将连接后未使用的接头引物破坏掉，降低了背景，高保真性扩增减少了错配的发生。

总体上，适宜的缓冲液和不需对中间体进行纯化的多重酶反应，大大缩短了文库制备的时间。

更多信息参考应用手册之“High Quality NGS Library Preparation of FFPE Tissues with ThruPLEX®-FD Prep Kit”.

 5. DNA-测序(DNA-seq)

简介

DNA测序已有几十年的历史，现在使用新一代测序技术可以在数小时内完成人基因组测序，对比以前需要数年的时间取得了难于想象的进步，NGS的关键技术是大规模平行测序，组成人整个基因组的DNA在基质上被捕获，通过同时进行上百万的测序反应，实现基因组DNA的快速测序。Illumina是NGS工业的排头兵，在适宜波长的光激发下，NGS系统使用一种高速相机检测掺入到DNA链中荧光标记核酸，软件对所获图像数据进行分析，生成数以百万的碱基reads，然后拼接形成序列。

工作流程

任何测序实验成功的第一步是DNA样品制备。经典的工作流程中，DNA首先经柱纯化，然后使用机械力剪切成上千的短双链分子。在此时，文库必须生成适合Illumina平台接头和indexes工作的状态。为了确保成功构建最高测序质量的文库，尤其是仅用有限量的DNA（ng）时，文库制备方法必须高效、精确，并避免纯化步骤，因为纯化可以导致DNA的大量丢失。

ThruPLEX^®技术

ThruPLEX^®在单管中进行，仅需三步即可完成

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第一步ThruPLEX^®技术卓越的修复反应

第二步 使用没有单链尾端的双链接头降低了背景。平端高效连接，封闭的5’端减少了接头间连接的发生。

第三步 通过连接后破坏掉未使用的接头而使大幅降低了背景值

总体上，使用适宜的缓冲液和不需对中间体进行纯化的多重酶反应，大大缩短了时间。

 

工作流程

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ThruPLEX-FD制备试剂盒为三步反应，在单管中进行。

 6. 胚胎植入前遗传学筛选与诊断(PGS/PGD)

介绍

胚胎植入前遗传学筛选与诊断(PGS/PGD)指的是在体外受孕流程中，为了选择没有染色体异常或不携带家族性疾病等位基因的胚胎，而对胚胎或卵母细胞进行的检测，这种检测提高了受孕几率，降低了特定遗传性疾病的发生率。芯片分析IVF中最常用的PGS技术，以BlueGnome (现已被Illumina收购)产品最常用。

工作流程

这一方法要从一个受孕的卵细胞中移走极体，或是受孕后第三天从5到10个胚胎细胞中移走一个细胞。然后裂解细胞，将释出的DNA用于扩增，扩增产物标记，与含基因组靶标的芯片杂交，软件分析确定拷贝数变异。PicoPLEX WGA技术因其极高的稳健性和可重复性，已经成为PGS的标准DNA扩增技术，PicoPLEX WGA技术还用于单细胞样或是分离所获pg级DNA的遗传学特性分析。

PicoPLEX技术

PicoPLEX用非互补引物通过随机引物延伸(random primer extension)生成高系统误差，低随机误差文库。

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最近发表的文献

Microarray-CGH for the assessment of aneuploidy in human polar bodies and oocytes. Jaroudi S, Wells D. Methods in molecular biology. 2013;957:267-83. DOI: 10.1007/978-1-62703-191-2_19.

Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Harton GL, Munné S, Surrey M, Grifo J, Kaplan B, McCulloh DH, Griffin DK, Wells D; PGD Practitioners Group. Fertility and Sterility. 2013 Sept 12;. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.2002

 7. RNA-测序(RNA-seq)

简介

整个基因组的大规模平行测序技术也可用于RNA测序中。分离的mRNA分子通过反转录生成cDNA，然后用于测序基因组DNA相同的技术来完成测序文库的制备。转录组测序已经成为一种很有价值的工具，不止用于基因表达分析，而且用于界定外显子/内含子的边界，证实和修订以前所注释基因的5’端和3’端边界，确定与疾病相关的剪切变异或融合转录本等。最后，RNA测序还是认识ncRNA, miRNA, tRNA和核糖体RNA等各种类型的小、大RNA功能很有价值的工具。

工作流程

文库制备是一个关键因素。小RNA容易降解而且量较少，选择最好的反转录酶和正确的文库制备方式是取得高质量结果的必要条件。我们推荐使用Clontech’s SMARTer®通用低初始量RNA文库制备试剂盒(Clontech’s SMARTer® Universal Low Input RNA Library Prep Kit)。绑定了ThruPLEX®技术的这类试剂盒(catalogue # 634945 or 634946)能成功扩增少量的DNA，工作流程十分简单。

ThruPLEX 技术

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第一步ThruPLEX技术具有高的修复反应

第二步 使用无单链尾端的双链接头降低了背景。高效的平端连接，封闭的5’端减少了接头间连接。

第三步 通过在连接后破坏掉未使用的接头，大幅度降低了背景

总体上，使用适宜的缓冲液和不需对中间体进行纯化的多重酶反应，大大缩短了文库制备时间。

工作流程

http://s5/mw690/0023pY0vgy6SdYUwX64a4&690Genomics" TITLE="NGS文库制备和单细胞基因组扩增（二）—Rubicon Genomics" />
Clontech’s SMARTer®通用低初始量RNA文库制备试剂盒(Clontech’s SMARTer® Universal Low Input RNA Library Prep Kit)使用ThruPLEX技术扩增极低量的起始DNA

 8. 染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)

介绍

染色质免疫沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)是一种用于确定和定位DNA结合蛋白与基因组序列相互作用的方法，这种方法用于研究基因调控或是染色质的组织形式。在经典的ChIP流程中，暂时结合了蛋白的基因组DNA经交联、片段化，将这些结合蛋白的DNA片段使用免疫沉淀的方法选择性富集起来，一旦纯化完成，这些DNA片段就用于构建测序文库。所获测序结果将提供感兴趣蛋白在DNA上的结合位点信息。

工作流程

纯化富集DNA的量一般很低。很多顶级实验室选用ThruPLEX-FD技术构建文库用于ChIP测序，因为这一试剂在低初始DNA量的情况下就能产生卓越的建库效果。

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ThruPLEX在单管中只需三步完成文库构建

第一步ThruPLEX技术具有高的修复反应

第二步 使用无单链尾端的双链接头降低了背景。高效的平端连接，封闭的5’端减少了接头间连接的发生。

第三步 通过在连接后破坏掉未使用的接头，大幅度降低了背景

总体上，使用适宜的缓冲液和不需对中间体进行纯化的多重酶反应，大大缩短了文库制备时间。

流程

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