dsRNA如何检测？如何检测、定性植物和动物dsRNA病毒或中间体？如何鉴别诊断病原体类型是细菌还是病毒？如何判定基因治疗用mRNA中dsRNA的污染情况？

J2，K1和K2抗体选择性的与双链RNA分子结合，亲和性高，且不依赖于双链RNA的序列情况，是完成上述工作的最佳选择。

English & Scientific Consulting Kft.即SCICONS，总部位于匈牙利的锡兹拉库(Szirák)，其主要产品为J2, K1和K2，三种与双链RNA分子杂交的小鼠单克隆抗体。这三种抗体销往全球35个国家，已经有200多篇科研论文选择了SCICONS产品。

1988年，世界上首次利用杂交瘤细胞系制备出抗双链RNA (anti-dsRNA)单克隆抗体。在1991年，Schönborn等人发表文章证实了这类抗双链RNA抗体的特异性（不与DNA或单链RNA分子结合。SCICONS从2005年开始经销J2，K1和K2。

在过去的十年间，这类抗体广泛应用于检测、定性植物和动物dsRNA病毒或中间体(intermediates)，包括丙型肝炎(Hepatitis C)，登革病毒(Dengue)，西尼罗病毒(West Nile Vius)和SARS等。另外，抗双链RNA抗体可用做鉴别诊断工具：辨别病原体是细菌还是病毒，包括在石蜡包埋固定的组织样品中(Richardson et al. 2010)。尤其是SCICONS的J2抗双链RNA单克隆抗体，已经成为免疫组织学方法检测dsRNA的金标准。

J2和K1两种IgG单克隆抗体通过冻干处理提供，无需冷冻运输，K2这种IgG单克隆抗体以杂交瘤上清形式提供，需冷冻保持和运输。

1.       抗体J2

J2抗双链RNA IgG2a单克隆抗体是dsRNA检测的金标准。最初用于研究植物病毒，自从2006年Weber等人的文章发表后，这一抗体的应用更加广泛。该篇文章中作者发现所有受测试的正链RNA病毒都在其感染的细胞中复制产生大量的dsRNA。如今已经有多达200多篇科研论文发表。

J2可用于检测多种病毒的dsRNA中间体，包括丙型肝炎，登革病毒，鼻病毒，基孔肯雅热病毒（又称屈公病毒），狂犬病毒，致脊髓灰质炎病毒，经典猪瘟病毒，禾草雀麦花叶病毒等(Hepatitis C virus, Dengue virus, rhinovirus, Chikungunya virus, Rabies virus, Polio virus, Classic swine fever virus, Brome mosaic virus)，包括在培养细胞或是石蜡包埋的组织样品中的dsRNA中间体，都可以使用J2检测。

J2曾被用于研究抗病毒反应如何起始，病毒采取何种策略来逃避机体的免疫防疫，定位病毒核酸复制点的超微结构来探索病毒的生命周期(Welsch et al., 2009 & Knoops et al., 2011)等。

J2在电镜观察，免疫荧光显微镜观察，免疫组织化学和包括点杂交和ELISA等多种免疫捕获方式中广泛应用。J2又被推荐作为检测自然界中未知病原体（是细菌还是病毒）鉴别诊断的工具(Richardson et al., 2010)。最近，J2被用于检测具有基因治疗应用价值的体外合成mRNA中dsRNA情况(Kariko et al., 2011)。

2.       抗体K1

K1 IgG2a单克隆抗体对dsRNA分子的亲和性与J2类似，可用于组织和细胞中双链RNA的检测。在J2不能产生令人满意结果时，K1可作为替代物解决交叉反应和/或消除背景。

K1可用于在培养细胞或是石蜡包埋的组织样品中检测dsRNA中间体，类型包括肝炎病毒，Theiler氏猪脑脊髓炎病毒或日本脑炎病毒等。

如果要检测Poly I:C，高度推荐使用K1，而不是J2，前者对合成的聚核苷酸亲和性更强(Schönborn et al. 1991)。

K1在免疫荧光显微观测，流式细胞仪和多种免疫捕获方式中应用(如点杂交和ELISA)。

3.       抗体K2

K2抗dsRNA单克隆抗体为IgM亚型。不推荐常规使用，因为J2和K1冻干品可以常温运输，而K2亚型高浓度下容易聚集，因此不能冻干保存，需要冰中运输。K2主要用于ELISA和夹心法ELISA，K2用于需要选择非IgG2a的其它型抗体来完成抗dsRNA杂交时选用。

应用领域

1.         免疫电镜(Immune electron microscopy)

上述抗体（首要是J2）已被多个研究组证实可用于病毒感染细胞中病毒复制复合体中dsRNA的超微结构定位。

Snijder教授研究显示急性呼吸窘迫病毒(SARS)和马动脉炎病毒(Equine Arteritis Virus, EAV)如何诱导连接到内质网的双膜小胞(double membrane vesicles, DMVs)形成，并研究了这些聚集的dsRNA如何作为复制中间体。Bartenschlager研究小组在登革病毒中观察到了类似现象。另有其他多个研究在免疫电镜研究中使用相应抗体。

http://s9/mw690/0023pY0vgy6Ry6EpnN638&690
免疫电镜影像：J2抗体标记显示在SARS-CoV感染Vero E6细胞7小时后，大量dsRNA（黑点），J2使用免疫金偶联的蛋白A检测。G: Golgi复合体，M: 线粒体，N: 细胞核，该图片来自 Knoops et al. (2008) PLoS Biol 6:e226.

详细实验方法可参看Leiden等人最近发表的论文。

参考文献

Knoops K, Kikkert M, Worm SH, Zevenhoven-Dobbe JC, van der Meer Y, Koster AJ, Mommaas AM, Snijder EJ. (2008) SARS-coronavirus replication is supported by a reticulovesicular network of modified endoplasmic reticulum. PLoS Biol 6:e226.

Knoops K, Barcena M, Limpens RW, Koster AJ, Mommaas AM, Snijder EJ. (2012) Ultrastructural characterization of arterivirus replication structures: reshaping the endoplasmic reticulum to accommodate viral RNA synthesis. J Virol 86: 2474-2487.

Welsch S, Miller S, Romero-Brey I, Merz A, Bleck CK, Walther P, Fuller SD, Antony C, Krijnse-Locker J, Bartenschlager R. (2009) Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe 5:365-375.

2.         免疫荧光(Immunofluoresence)

所有三种抗体(J2，K1和K2)都曾用于dsRNA免疫组织学检测，这是这类抗体的最常用方式，已经有200多篇文献可供参考。组织（固定的培养细胞或薄的组织切片）与抗体孵育，抗体与dsRNA高亲和性结合，结合的抗dsRNA抗体使用标记的二抗（间接免疫染色）观测（选择特异针对小鼠IgG2a (对J2或K1)或IgM (对K2)的荧光染料或酶标二抗）。

http://s1/mw690/0023pY0vgy6Ry71s8xOa0&690

免疫荧光显微镜使用J2抗体显示感染了登革病毒的HuH-7细胞中的dsRNA（红色标记），dsRNA是病毒复制复合体的标志物。细胞DNA被DAPI标记（蓝色），该图来自Anwar et al. (2011) PLoS One 6:e23246.

间接免疫荧光通过多种荧光标记方式（FITC，罗丹明和多种Alexa Fluor®染料等）或是使用免疫酶学标记方法（过氧化物酶标记的二抗）。多种类型的二抗（兔，山羊，绵羊和驴）和其修饰型（如F(ab')2衍生物）都能找到成功的事例。

3.         免疫捕获(Immunocapture)

包括ELISA定量检测dsRNA，或使用夹心法ELISA，或点杂交（定量，特异性检测），免疫沉淀或免疫印迹（在聚丙烯酰胺凝胶中分离并定性dsRNA）等多种方式使用这类抗体分离或检测dsRNA。

http://s1/mw690/0023pY0vgy6Ry7pq53yd0&690
J2抗体通过点杂交检测圭亚那利士曼原虫(Leishmania parasite L. guyanensis)中利士曼RNA病毒(LRV)。图片取自Zangger et al. (2013) PLoS Negl Trop Dis 7:e2006.

因不依赖双链RNA序列，且具有高度的亲和性，这类抗体多采用点杂交方式检测RNA产品中dsRNA污染情况，成为基因治疗用mRNA产品质量的一个重要指标。

参考文献

Schönborn J, Oberstrass J, Breyel E, Tittgen J, Schumacher J, Lukacs N. (1991) Monoclonal antibodies to double-stranded RNA as probes of RNA structure in crude nucleic acid extracts. Nucleic Acids Res 19:2993-3000.

Zangger H, Ronet C, Desponds C, Kuhlmann FM, Robinson J, Hartley MA, Prevel F, Castiglioni P, Pratlong F, Bastien P, Müller N, Parmentier L, Saravia NG, Beverley SM, Fasel N. (2013) Detection of Leishmania Virus in Leishmania parasites. PLoS Negl Trop Dis. 7:e2006.

Bauhofer O, Summerfield A, McCullough KC, Ruggli N. (2005) Role of double-stranded RNA and Npro of classical swine fever virus in the activation of monocyte-derived dendritic cells. Virology 343:93-105.

Kariko K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. (2011) Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res 39:e142.

Kaneko H, Dridi S, Tarallo V, Gelfand BD, Fowler BJ, Cho WG, Kleinman ME, Ponicsan SL, Hauswirth WW, Chiodo VA, Kariko K, Yoo JW, Lee DK, Hadziahmetovic M, Song Y, Misra S, Chaudhuri G, Buaas FW, Braun RE, Hinton DR, Zhang Q, Grossniklaus HE, Provis JM, Madigan MC, Milam AH, Justice NL, Albuquerque RJ, Blandford AD, Bogdanovich S, Hirano Y, Witta J, Fuchs E, Littman DR, Ambati BK, Rudin CM, Chong MM, Provost P, Kugel JF, Goodrich JA, Dunaief JL, Baffi JZ, Ambati J. (2011) DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature 471:325-330.

Cruz C, Housley J. (2014)  Endogenous RNA interference is driven by copy number. eLife 2014;3:e01581

Lukacs N. (1994) Detection of virus infection in plants and differentiation between coexisting viruses by monoclonal antibodies to double-stranded RNA. J. Virol. Methods 47:255-272.

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