分子识别之利器-核酸适配体(aptamer)_群晓生物

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分子识别之利器-核酸适配体(aptamer)

(2014-04-26 11:04:22)

标签：

抗体

aptamer

核酸适体

核酸识体

核酸适配体

分类：科苑进展

分子识别—抗体的历史与特点

无论是在基础科研还是在临床实践中，检测并定量某些类型的分子都是最基本的工作。定量的特异性和准确性构成了科研数据和临床诊疗效果可信性和有效性的基础。因此，对仪器和检测方法提出越来越高的要求。

谈到分子识别（亲和试剂），抗体的战功可谓大矣。抗体作为生命科学工具首次出现在上世纪50年代。上世纪70年代出现了通过免疫动物制备多克隆抗体技术，使抗体在分子识别领域得到广泛应用，进而又导致这种通过动物免疫获取多抗的方法实在难于满足对抗体的大量需求。后来Kohler和Milstein报道了能大量生产单克隆抗体的技术。现在，在生命科学领域的各个角落都可以看到抗体的身影，其应用之广，有目共睹。

理论上，通过培养、传代产单抗的细胞，可以获取无限量的抗体以满足科研和诊断的需求。但是，事实上抗体也有其本身固有的多种弱点：首先，抗体的产生源于动物，对于动物不能耐受的分子，如某些毒素，要得到针对它们的抗体就困难了，对于某些免疫原性比较弱的分子，同样难于获得抗体；其次，杂交瘤生成多限于大鼠或小鼠，所获抗体因在人体内容易产生假阳性而限制了其在临床诊断和治疗中的应用；再次，单克隆抗体确认和制备困难，有时需要花费繁重的劳力，筛选大量的细胞克隆；还有，产抗体的杂交瘤细胞需小心存放，避免出现事故导致细胞丢失或死亡；通常通过在动物腹膜腔种植杂交瘤细胞并由腹水中获得大批量的单抗，而实践中，有的杂交瘤细胞在动物腹腔中难于存活，阻碍了大量单抗的获取；抗体的效价有内在波动，存在批次间差别，不同批次抗体的使用条件需要优化；抗体的生成限定在生理条件之下，即抗体与其靶标分子之间相互作用的动力学参数不能根据需要改变；抗体对温度敏感，保质期相对较短，容易发生不可逆变性而失活。

近些年来，核酸操控技术飞速发展，发展了多种方法克服杂交瘤细胞抗体技术的缺点。1990年出现了体外抗体结合变异区的噬菌体展示技术(in vitro display of the antibody binding variable region on phage)，继而出现了选择整个抗体Fabs片段的噬菌体展示技术(selection of intact antibody fragments (Fabs) using phage display)；还包括抗体人源化(humanization of antibodies)，抗体工程化(antibody engineering)和体外免疫(in vitro immunization)等手段。相对单克隆抗体，体外展示技术具有多种优点，尤其表现在基因序列与亲和试剂的标记方面。与此同时，出现了一种叫做aptamer的新型分子识别元件，导致分子识别领域迎来了一次重要的新变革。

Aptamer是什么？其发现的历史过程

Aptamer有中文译作核酸适配体(也有人译为核酸识体、核酸适体或核酸适配子)，是能够高亲和力和稳定性结合目标抗原的单链RNA或DNA分子。现在其抗原类型更为广博，已经发展了针对涵盖包括小分子有机物、多肽、蛋白、组织和细胞等不同目标分子和细胞的aptamer。Aptamer技术由L. Gold和J. Szostak (2009年获诺贝尔生理学和医学奖)最早提出。1990年Gold研究组运用体外筛选技术获得能与T4 DNA聚合酶特异性结合的RNA分子，并将其运用的寡核苷酸配体筛选方法定义为配体指数富集的系统进化(the systematic evolution of ligands by exponential enrichment process)，简称SELEX。同年，Szostak等人也报道了能结合小分子有机染料的RNA片段。SELEX所得寡核苷酸探针命名为aptamers，该词来源于拉丁词aptus，英语指“to fit”，翻译成汉语即“适”的意思。Gold和Szostak的这一突破性研究证实核酸分子能够借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成与分子靶标相作用的结合口袋和裂隙(binding pockets and clefts)，借助这些特殊的三维立体结构，高亲和力和特异性的识别并结合靶分子。

传统SELEX技术不外乎如下5个步骤：(1)设计、合成庞大的随机核酸库，并在特定缓冲体系下与靶分子孵育；(2)将与靶分子结合的核酸序列和非结合的核酸序列（通过离心、滤膜、磁珠、毛细管电泳、层析等手段）分离；(3)通过反筛选排除非特异性结合的序列；(4)对所获特异性结合序列进行PCR扩增得到次级核酸库，在重复以上筛选步骤，最终获取达标的核酸分子；(5)对所获核酸序列克隆测序，并鉴定其与靶分子结合的特异性和亲合力。现今发展了多种新型SELEX筛选方法，推进了aptamer筛选流程的自动化和快速化，使SELEX筛选的特异性和效率显著得到提升，这些手段包括Counter-SELEX, Cell-SELEX, One step MonoLEX, Microfluidic SELEX, Toggle-SELEX，CE-SELEX，automated-SELEX，tailored-SELEX，photo-SELEX，microfluidic-SELEX和FACS-SELEX等，下面以应用潜能巨大的Cell-SELEX为例论述：

多种流式细胞学方法通过检测细胞表面蛋白确定细胞类型或是检测疾病相关分子基序(motifs)。最初，也是利用针对分离所得细胞表面蛋白的aptamer来评价其用于流式细胞检测能力的，几年以后，Cell-SELEX这种使用整个细胞的新筛选方法的出现扩展了aptamer作为分子探针在细胞筛选中的重要作用。Cell-SELEX是指制备能和感兴趣细胞相结合、特异性aptamer的方法。简述如下：单链DNA文库与目标细胞孵育，非特异性结合的DNA洗脱，结合在细胞上的DNA通过加热分离、离心收集，过滤掉能够非特异性结合其它细胞类型的核酸分子后，富集特异性分子，同时通过一种或者多种非靶标细胞的反选择(counter selection)，将非特异性结合的序列筛除掉；使用isothiocyanate标记的正链和biotin标记的负链引物PCR放大特异性结合序列，然后去除负链，生成单链DNA库，进行下一轮筛选，经多轮如此反复的筛选工作，选择过程由流式细胞仪检测其荧光活性的增长强度，最终获得针对这一特定细胞类型高结合特异性的aptamer分子，整个过程耗时3个月左右。Cell-SELEX克服了针对细胞表面特异蛋白来设计探针分子的诸多缺点：因为细胞表面蛋白通常以整合或锚定的形式结合在细胞膜上，细胞内和被细胞膜包埋的蛋白部分无法被结合试剂辨认，因此针对这类细胞表面蛋白获得的aptamer未必能在自然条件下于细胞表面辨认这一蛋白分子。Cell-SELEX筛选所得aptamer更适合作为高特异性的探针分子。这种方法对细胞特异性分子（是否已明确）没有要求，在疾病特异性生物标志物研究领域具有很大的优势。当然，使用这种方法得到的aptamer也许并不针对细胞表面的蛋白，针对的也许是细胞表面的糖或是脂类分子。

虽然在实验室研究中，aptamer已经有一段历史，但是其商业化应用还未真正广泛开展起来。其应用障碍包括：Cell-SELEX过程在人为环境中完成，这些人为环境与生理环境不同，因此得到的aptamer可能会与其它非靶标细胞结合产生假阳性结果。虽然Cell-SELEX过程中应用了至少一种细胞来反筛选，但因细胞类型的多样性，难于排除aptamer与其它类型细胞产生假阳性结合的情况，使用更多的非靶标细胞进行反筛，并使用血清或其它添加蛋白来增加缓冲盐的复杂性能对降低交叉反应起到较好效果，不过这在另一方面，又增加了选择的难度、增大了aptamer选择失败的风险。

但随着Cell-SELEX技术的日趋完善、成熟，其广泛应用道路上的诸多挑战正在被一一逐步克服，其在细胞流式分选中的应用前景也日益明朗化。伴随着对细胞表面CD系列分子的认识，完全可以筛选、确认，并使用aptamer替代目标蛋白抗体开展相应细胞的流式细胞分选。Aptamer因价格和易合成等诸多优势，不久的将来可能会对抗体在细胞分选中的地位构成挑战。

Aptamers的优点及与抗体的比较

Aptamer特有的生化特性使其具有多种优点：与抗体相比，aptamer的筛选、确认在体外进行，不依赖于动物、细胞甚至在体条件，且其大规模生产并不需要免疫、组织培养和血清纯化等步骤；基于核酸的aptamer骨架结构更具刚性，侧链则比抗体具有更多扭曲构型，核酸aptamer能容忍更苛刻的环境条件；aptamer与靶分子的的亲合力强（Kd为微摩到皮摩水平）、特异性高；aptamer的特性可因需要呈现可变性，完全可以选择适宜体外诊断的条件来筛选针对某一特定靶标的aptamer，例如，可以筛选获得非生理性缓冲液和非生理温度下与目标分子特异性结合的aptamer，而不必如抗体一样拘泥于生理条件，即其结合靶标的结合率和解离率等动力性参数可以根据需要变更；aptamer的靶分子范围极广：涵盖从小分子有机物、蛋白、细胞因子等生物大分子到病毒、细菌和细胞等，aptamer的产生不依赖于动物和细胞，针对动物难于耐受的诸如毒素和不易产生免疫原性的小分子也能制备出特异性aptamer，而Cell-SELEX可以用于筛选获取从细菌到肿瘤细胞多种细胞类型表面的未知分子标志物(biomarkers)；aptamer由化学合成完成，制作aptamer无论是金钱还是在时间花费上都比单克隆抗体有优势，一旦aptamer制备完成，因其序列已知，就可以通过寡核苷酸合成方法实现精准重复和丰产制备，克服批次差别；最初，困扰aptamer的应用的一个重大难题是其在体内应用的稳定性：Aptamer作为小分子核酸在体内很容易被核酸酶破坏清除，半衰期短，如今通过对aptamer进行修饰，以大幅度提高了抗核酸酶降解的能力和体内稳定性；报告子、酶和荧光标签分子如fluorescein和biotin等易于对aptamer实现精确的位点修饰和标记；aptamer稳定性好，可以长时间保存，变性复性可逆，对运输条件要求宽松；aptamer免疫原性小、组织渗透性好。除了以上所列，aptamer的另一个显著优点是可以通过核酸相关方法（类似DNA检测和PCR反应等）进行检测和定量；高通量蛋白定量领域，基于aptamer开发的蛋白芯片较传统的抗体芯片具有更大的承载和分析能力，例如由SomaLogic公司开发的叫做SOMAscan的新型蛋白质组学技术已经投入到商业化运营中，为临床蛋白分子标志物的发现开拓了新天地。

如果要探究aptamer在被发现后的一段时间中被忽视的原因，应该主要因为aptamer与已经主导分子识别领域的抗体功能类似，而相对于已存在的庞大的抗体大军，短时间内完成能与抗体体量抗衡的、针对如此众多靶分子、高亲和性的aptamer是不现实的。另外，知识产权问题一定程度上限定了aptamer的大范围推广（这一问题同样困扰着体外展示抗体的推广）。但经过二十多年的发展，aptamer技术取得了长足的进展，包括核酸合成技术的进展使随机核酸库构建更便捷、高效；核酸修饰技术的进展使aptamer更稳定、更具有与蛋白类似的特性等，使aptamer的应用领域更广阔。

应用领域及前景

正如aptamer拉丁文意所寓，aptamer是分子识别的利器，能广泛应用于包括基础科研、临床诊断和治疗实践之中。现今已发展了多种aptamer的体外筛选方法，正进一步在aptamer领域掀起新一轮革命，新技术为aptamer筛选节省了时间、提高了效率，所获aptamer的亲和力和选择性更好。Aptamer可以通过修饰加入多种功能集团或是核酸衍生体，同样可以和多种用于临床治疗的诸如药物、药物载体、毒素和光敏物质(photosensitizers)连接，在药物靶向递送和分子成像等领域具有无限的应用潜力。无论是在临床治疗领域，还是在体诊断和体内成像领域aptamer都将有广泛的应用前景。

单就基于aptamer的成像技术为例：通过连接fluorophore, quantum dots，或gadolinium等材料，aptamer成像探针可以在包括光学成像和MRI, PET, SPECT, CT和超声等多种成像手段中得到广泛应用。使用fluorescent或bioluminescent分子进行光学成像是一种相对经济的成像方式。基于aptamer的光学成像可分为直接成像和activatable探针法两种方式。直接成像即通过aptamer连接荧光分子来实现，是最广泛应用的方法。activatable probes法是基于aptamer构象改变来成像的方法，其设计基于aptamer结合靶标后引起构象改变从而荧光信息被激活的原理。在诊断领域，当前的诊断平台，也主要是基于更好的适应抗体所需条件而设计。发现aptamers在亲和性和特异性上可以与抗体媲美后，将对未来的诊断手段和平台产生相应影响。如今Aptamers已经在多种诊断平台上使用并取得了令人鼓舞的成果。利用aptamer对癌症病人样本进行染色，通过流式细胞方法实现对癌症的快速诊断。可以说凡是涉及抗体的诊断领域，几乎都可以用aptamer替代，并弥补抗体的不足。将aptamer整合到微流控芯片装置和纳米生物传感器上则可实现对疾病的早期诊断。在分子治疗领域，2004年，FDA批准了第一种aptamer药物Macugen。如今已有更多产品通过FDA审批。SELEX技术可筛选在疾病发生和进展过程中的关键靶分子，或是直接针对癌症细胞的aptamer。将aptamer和抗癌药物连接，通过基于aptamer的多模式成像探针给药，能更精确的开展实时监测和治疗，降低药物本身的毒性，阻断或封闭该靶分子、细胞的功能，提高治疗的有效性，达到靶向治疗疾病的目的。

Aptamer当然不是所有分子识别问题的终结者。但可以肯定的说aptamer可以更好的在很多抗体不适合的环境或情境下发挥其独特的作用。随着SELEX技术的进步，高通量aptamer筛选正给予aptamer研究加速向前的强大动力。虽然当前aptamer应用还处在襁褓中，但其新事物的强劲生命力必将随时间前进的步伐在分子识别领域得以淋漓酣嬉地舒展。

注：基于对相对新鲜事物的欢迎和鼓励态度，对aptamer做了这篇介绍性文字。aptamer与抗体都是重要的分子识别工具，文中着重论述了aptamer的优点，多次提到两相比较中抗体的劣势。但事实上，两者各有优劣，都是在不断发展中完善着自我，更应用发展的态度看待它们。若该文给人一种偏袒aptamer的感觉，如此注开头所言：纯属基于对相对新鲜事物的欢迎和鼓励之态度，请看官明鉴。

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