概述

    1977年Sanger发明了末端终止测序法（sequencing by chain termination technique），经不断改良成为当今DNA测序的主流。2007年以来，出现了多个下一代测序技术平台（next-generation sequencing, NGS）。NGS又称第二代测序，其特点为对经克隆放大的DNA分子的大规模平行测序（massively parallel sequencing of clonally amplified DNA molecules）。如今，测序技术研究步入了第三代测序阶段（单分子DNA测序）：通过在分割的多个小室平行实现对单分子的测序。这些新测序技术（第二、三代测序）一次可获得几百Mb （megabase）至上Gb （gigabase）的碱基序列。海量的测序信息将强力推动科学和医疗的发展。 

                                          正文

    1977年Sanger发明了具里程碑意义的末端终止测序法，Maxam和Gilbert发明了化学降解法（sequencing by chain fragmentation technique）。Sanger法经不断改良，成为当今DNA测序的主流。近些年，随着技术的发展，产生了通量更高、速度更快的第二代测序技术。第二代测序技术基于为边合成边测序（Sequencing by Synthesis)概念，这一概念的出现为测序仪小型化奠定了基础。基于这种概念的测序有两种策略：一种是循环可逆终止技术（cyclic reversible termination technology），即添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，然后切除荧光基团，如此循环往复；另一种策略是焦磷酸测序法（sequenced by detecting pyrophosphate release），焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi），PPi最终转化为可见光信号。现有的二代测序平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID系统等，简述如下：

1.       Roche 454测序技术

    美国454 Life Sciences公司（现被美国罗氏公司收购）的第一台新一代测序仪为454测序仪。454测序仪采用焦磷酸测序法，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都在固态芯片上完成，无需电泳之类的物理分离过程来区分碱基，从而实现了小型化和多路并行的、集成化的测序仪。

2.       Illumina Solexa测序技术

    Illumina公司的第二代测序仪最早由Solexa公司研发，Illumina于2007年收购了Solexa。Illumina/Solexa Genome Analyzer用不同颜色的荧光标记四种dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

    测序的操作流程如下：Solexa测序反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。待测序基因组DNA经随机片段化，并在两头加上特定的接头（Adaptor），进而变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，添加未标记的dNTP和Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，在Flow cell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段，进而加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，捕获荧光信号，获得待测片段的序列信息。

3.       ABI SOLiD测序技术

    ABI公司推出的SOLiD（Supported Oligo Ligation Detetion）测序平台以四色荧光标记寡核苷酸的连续合成反应为基础，并利用特有的"双色球编码技术"提供了一个纠错机制，提高SOLiD的系统准确性。

AB SOLiD测序仪能够将富集模板片段的微珠在芯片上进行高度可控的任意排列。AB SOLiD测序仪使用微乳液PCR方法扩增模板片段。PCR扩增反应结束之后，微乳液滴被打破，小磁珠被富集起来固定到固态平板上，制成高密度测序芯片。后面的合成测序法由DNA连接酶而非DNA聚合酶完成。

    流程简述如下：首先，通用引物与模板片段两端的接头序列互补结合，然后连接酶将一个被荧光标记的8 bp核酸探针片段（fluorescently labeled octamers）连接到引物末端。这段探针片段是经过设计的，比如其中第5位碱基上标记了荧光。连接反应完成之后，采集荧光图像，然后在第5位碱基和第6位碱基间切断，去除荧光标签。如此反复，获得每间隔4个碱基的第5号碱基的确切信息；经过几轮之后，已经获得延伸的引物变性脱落，再重新结合上新引物从头开始新一轮测序，通过使用不同长度的引物（+1或者-1）或者使用在不同位点标记荧光的8 bp核酸探针片段获得另一等间隔位点上的信息。如此反复，最终获得模板片段的完整序列信息。AB SOLiD测序仪使用了双碱基编码技术（two-base encoding），它是通过两个碱基来对应一个荧光信号而不是传统的一个碱基对应一个荧光信号，这样每一个位点都会被检测两次，通过这种误差校正功能，明显降低测序的出错率。

    二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或改变样品中核酸分子的比例。另外，第二代测序的读长偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。当前，业界发展着以单分子测序（Single Molecule Sequence, SMS）和纳米孔测序为标志的第三代测序技术。SMS测序技术主要包括两种方式：(a) 核酸外切酶测序（Exonuclease sequencing）外切酶每次在掺入了荧光核酸的转录本上切割下一个碱基，并经荧光光谱确定其类型； (b) 边合成边测序（Sequencing by synthesis, SBS）在合成中检测掺入的荧光信号，荧光信号在下一个碱基合成前被去除，如此循环进行，4种核酸分子可标记相同(例如Helicos Biosciences的tSMS技术采用Cy5)或不同的荧光染料，SBS包括Helicos Biosciences的True single-molecule sequencing (tSMS TM)，VisiGen的基于Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)的测序（FRET-based approach），Pacific Biosciences的SMRT sequencing等。第三代测序还包括纳米孔测序（Nanopore sequencing），杂交辅助的纳米孔测序（Hybridization-assisted nanopore sequencing, HANS），透射电镜DNA测序（Transmission electron microscopy for DNA sequencing）等类型。如今三代测序技术受到科学界深切的关注，当前研究人员认为三代测序技术并不能克服所有一、二代测序技术的缺点和不足，也并不表示可以完全取代以前的测序技术，这种新技术只有通过进一步的发展和完善，才能更客观的评估其能力和不足(Gupta 2008)。

1. Helicos公司

    HeliScope测序仪实际上是一种循环芯片测序设备。首先，将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子，并加上poly-A尾。然后通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片。最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息。Heliscope的读取长度约为30-35 nt，每个循环的数据产出量为21-28 Gb。

2. Pacific Biosciences公司

    Pacific Biosciences公司的SMRT技术也是基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP（荧光标记的位置在磷酸基团）放入ZMW孔进行合成反应。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的类别判定dNTP的种类。其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团被切割释放，荧光分子离开荧光信号检测区。

3. Oxford Nanopore Technologies公司

    电压梯度驱动RNA或DNA分子通过纳米孔，并产生特异的信号现象，这种现象的发现为使用单通道技术检测低拷贝未经修饰的核酸分子提供可能。Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术就是基于这种电信号的测序技术。他们使用以α-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电信号特征，通过电信号特征确定碱基的类型。虽然当前该技术还处于理论和实际探索阶段，但前景极具吸引力(Rhee and Burns 2006)。

新测序技术的应用

    测序技术的新进展使基因组研究正处于二次革命阶段。有人预计未来三代测序技术可能主导测序市场，基于此类技术的小型化测序仪大量进入实验室，会使高通量测序技术更普及和方便。测序技术的应用十分广泛，下面将仅举例说明：在基因组水平上对没有参考序列的物种进行测序可为分类和基因组功能、特性研究奠定基础；对有参考序列的物种，在全基因组水平上扫描检测突变位点，可研究个体差异的分子基础；全转录组测序，可开展剪接、编码序列单核苷酸多态性等研究；通过分离、测序特定大小的RNA分子，可发现新的小分子RNA；新测序技术与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，可检测与特定转录因子结合的DNA区域和基因组的甲基化位点；使用核酸酶消化mRNA时，处于翻译过程的mRNA分子因核糖体结合而保留下约30bp的mRNA片段，将这些被保护的mRNA片段构建文库，再对文库进行测序，可从整体上检测蛋白质的翻译状况；新测序技术在临床诊断上的前景难于估量(Voelkerding, Dames et al. 2009)，例如，新测序技术与微阵列结合产生的目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）：利用微阵列技术合成能够与基因组上的特定区域互补结合的特定寡核苷酸探针，用于富集基因组特定区段，然后对这些区段进行测序，可用于寻找疾病的候选基因。

部分参考文献

Jonathan M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): 1117-1124.

Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10):1135-1145.

Jonathan M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): 1117-1124.

Daniel Branton, David W Deamer, Andre Marziali et al. (2009) The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology 26(10): 1146-1153.

Cole Trapnell & Steven L Salzberg. (2009) How to map billions of short reads onto genomes. Nature Biotechnology, 27(5): 455-457.

Natalie de Souza. (2009) Deep sequencing of ribosome footprints. Nature Methods 6(4): 244-245.

Gupta, P. K. (2008). "Single-molecule DNA sequencing technologies for future genomics research." Trends Biotechnol 26(11): 602-611.

Rhee, M. and M. A. Burns (2006). "Nanopore sequencing technology: research trends and applications." Trends Biotechnol 24(12): 580-586.

Voelkerding, K. V., S. A. Dames and J. D. Durtschi (2009). "Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics." Clin Chem 55(4): 641-658.

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