单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指在基因组水平上由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态现象，其中最少一种等位基因在群体中的分布频率不小于1%。理论上，SNP包括单碱基的转换(transition)，颠换(transversion)，插入及缺失等形式，但通常所指SNP不包括单核苷酸的插入和缺失；对于单个碱基的变换，理论上讲SNP既可能是二等位多态性(转换)，也可能是3个或4个等位多态性(颠换)，但SNP通常为一种双等位基因(biallelic)，即二态的遗传变异(转换)。

SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种形式。根据分布位置，可分为基因编码区SNPs (coding-region SNPs，cSNPs)、基因周边SNPs (perigenic SNPs，pSNPs)以及基因间SNPs (intergenic SNPs，iSNPs)。cSNP在遗传性疾病研究中具有重要意义，从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP (synonymous cSNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译蛋白质的氨基酸序列；另一种是非同义cSNP (non-synonymous cSNP)，指碱基序列的改变可使翻译的蛋白质序列发生改变，从而可能影响蛋白质的功能，导致生物性状改变；位于编码基因周边的SNP可能通过影响编码基因的转录水平而影响生物性状。SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的。SNP在非转录序列要多于转录序列，而且在转录区非同义突变的频率比同义突变的频率低。

SNP虽然不及RFLP (restriction fragment length polymorphism)和短串联重复序列STR(short tandem repeat)标记变异程度高，但SNP数量巨大，分布广泛，就整体而言，其多态性要高得多；另外，SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)，易实现分析的自动化，使SNP成为继微卫星(microsatellite)多态标记后的第三代遗传标记。SNP与许多疾病相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的重要因素，SNP分析在群体遗传学、疾病易感性研究、新药研究和分子诊断等领域具有重要的地位。

SNPs检测方法

SNPs检测的方法多样，可大致分为如下类型（但是不同类型之间多有交叉，使分类困难，尤其是对基于杂交的方法和DNA聚合酶延伸的方法）：常规测序方法；基于杂交的方法：包括DASH (dynamic allele-specific hybridization)，分子信标Molecular beacons，和SNPs microarrays等；基于酶的方法：引物延伸法(Primer extension)，外切酶法(5’ nuclease, Taqman法即基于此；FLAP endonuclease通过结构特异性切割错配识别SNP)，内切酶法(Restriction fragment length polymorphism, RFLP法)，连接酶法(Oligonucleotide ligase assay)等；以构象为基础的方法：SSCP (Single strand conformation polymorphism)，DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), TGGE(Temperature Gradient Gel Electrophoresis), Denaturing high performance liquid chromatography, High-resolution melting of the entire amplicon等，分述如下：

1. 直接测序法：对待检测片段进行直接扩增、测序，是最准确的方法：纯合型SNP位点的测序峰为单一峰，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰。

2. 基于杂交的方法：基于寡核苷酸与靶序列变异配对时的杂交稳定性（ΔTm）差异进行检测。等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotide hybridization，ASO)探针与DNA样品的多重PCR产物阵列杂交，可扫描多个病例样品中数个致病等位基因(multiplex allele-specific diagnostic assay，MASDA)。基于ΔTm的杂交方法还包括LNA (locked nucleic acids)，PNA (peptide nucleic acids), DASH (dynamic allele-specific hybridization)等多种类型。基因芯片(gene chips)又称DNA芯片(DNA chips)，也属于阵列杂交分析方法，通过用标记的探针与特定的DNA样品杂交，然后检测杂交信号的强弱判断样品中靶分子的数量。由于该技术可以将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的DNA分子进行检测分析，成为现今常用的SNP分析手段。基因芯片检测技术的主要过程：首先，用生物素标记扩增后的靶序列或样品，然后与芯片上大量的探针进行杂交；其次，用含链霉素的荧光素作为显色物质，用激光共聚焦显微镜或其他荧光显微镜扫描，对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的Watson-Crick配对双链与具有错配碱基的双链分子相比具有较高的热力学稳定性，从而通过荧光信号的强弱将其区分开来。分子信标法(molecular beacons)德供体和受体荧光染料分别位于有互补序列的探针两侧，当未与靶序列杂交时，探针形成一个"发夹环"结构，使供体-受体染料对相互靠近而淬灭，反之，探针与正确的靶序列杂交时，染料对分离，荧光信号增强，探针的发夹结构设计使错误杂交不稳定，从而构成对SNP的选择性。

3. 以构象为基础的SNP检测技术：温度梯度凝胶电泳或变性梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE或Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)：Tm值不同的DNA片段将表现不同的解链行为，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中设置温度梯度，当片段的温度到达它最低熔解区域即开始解链，从而降低了在凝胶介质中的迁移速率，实现分离，即为TGGE的工作原理。DGGE利用双链DNA分子在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳时，会在一定变性剂浓度下发生部分解链，导致电泳迁移率下降。分别具有一种SNP等位基因型的两种DNA分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同时间发生部分解链，从而被分离成两条带。DGGE与TGGE类似，只不过DGGE依靠变性剂使Tm值不同的分子分离，而TGGE依靠温度梯度分离Tm值不同的分子。单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)：在非变性的条件下，单链DNA具有由它的核苷酸序列决定的折叠结构，有一个碱基发生改变时，会使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。利用此特征通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过比对同一板电泳胶中纯合突变SNP、杂合子、正常的DNA的参照片段，确定SNP类型。SSCP是一种简单、高效地检测DNA或RNA序列中点突变的技术，实验成本较低，是一种目前较为常用的方法。变性的高效液相色谱检测(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)：以SSCP和DGGE为发展的SNP检测技术：将未知的DNA片段与野生型DNA混和，经加热变性后再使其降温重退火，若有突变的DNA，即形成同源双螺旋和异源双螺旋，通过控制DHPLC的温度，将系统维持在异源双螺旋变性，而同源双螺旋未变性的温度下进行分离。高分辨率溶解曲线(High Resolution Melt，HRM)，通过比对不同DNA分子溶解度的不同从而检测突变的方法。

4. 基于酶的方法：同样存在多种基于酶的检测方法，仅就基于DNA聚合酶的方法就包括等位基因特异的PCR，和引物延伸法等，另外还有基于连接酶、外切酶和限制性内切酶(限制性片段长度多态性分析法restriction fragment length polymorphism，RFLP：利用限制性核酸内切酶识别并剪切特定DNA序列的能力，检测基因片段上限制性核酸内切酶识别位点处是否存在核苷酸突变，而后通过电泳迁移率的不同来判定是否存在SNP)等方法。Taqman方法利用Taq酶的5’核酸外切酶活性，切割与PCR扩增产物结合的DNA探针（探针5’和3’分别结合供体染料与受体染料），Taq酶切割使供体染料与淬灭的受体染料分离，使供体染料的荧光极大增强。延伸产物检测的方法又可分为：放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法(如MALDI-TOF)、高压液相色谱法(dHPLC)等，可以说引物延伸法和芯片杂交法是当前发展最迅速的检测方法了。多种公司开发了多种产品用于SNP检测： 

数据库

Human Gene Mutation Database (HGMD)

http://www.hgmd.org/

Database of Single Nuleotide Polymorphisms (dbSNP)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

The International HapMap Project

http://snp.cshl.org

The Allele Frequency Database

http://alfred.med.yale.edu/alfred/index.asp

JSNP

http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/

GeneSNPs (National Institute of Environmental Health Sciences)

http://www.openhelix.com/cgi/tutorialInfo.cgi?id=91

研究现状

疾病易感性(相关性)SNP研究进入理性降温期。当前基于大样本、高通量和功能验证的SNP研究才具有更好的说服性。另外，分子流行病学研究同时更注重考虑环境风险因素的影响；对于多中心的联合研究，对质量控制标准和实验的重现性要求将更苛刻。对于候选SNP的遴选，有很多种考虑，总的趋势和出发点是能够涵盖的SNP越多越好。我国在疾病易感性SNP研究上因人口基数大，病例样本量大而具有独特的优势。

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