第五章：植物细胞培养和次生代谢产物生产  

1．植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。

2. 植物单细胞分离

  由完整的植物器官中分离单细胞

  机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。

      ①细胞不受到酶的伤害；②不用质壁分离；③细胞产量低；④细胞易破。

  酶解法：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。

① 细胞受到酶的伤害；②要质壁分离；③细胞产量高；④细胞不易破

  由培养组织分离单细胞：从培养的未分化的且疏松易碎的愈伤组织中分离单细胞

3．植物单细胞的培养技术

   平板培养：植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。

   看护培养和饲养层培养：看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。

                         饲养层培养用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。

   液体浅层静置培养法：将一定密度悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层封口静止培养。

   细胞悬浮培养法：细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。

   微室培养：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法

4. 植物细胞的大规模培养（p89-p95）

  悬浮培养：分批培养，连续培养，半连续培养

  固定化培养：包埋法，吸附法

  植物细胞大规模悬浮培养的优点

 　 1）可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养吸收。

    2）可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害。

3）保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果

细胞同步化（synchronization）是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期，使细胞保持相对一致的细胞学和生理学状态，便于研究细胞分裂和细胞代谢。

细胞固定化定义:将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。

细胞固定化具有以下意义

　　1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。

　　2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。

　　3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。

　　4）有利于进行连续培养和生物转化。

5. 影响次生代谢产物的因素

1）生物因素：细胞株，细胞凋亡，细胞团，生物合成机制

2）化学因素：营养盐，前体，诱导子，反馈抑制

3）物理因素：光照，温度，PH

    4）工程技术问题：培养液的流变特性，气体传递，搅拌与剪切力，泡沫与器壁表面粘附性

   提高次生代谢产物产量的途径

    1）培养设备：选择或设计合适的生物反应器。

    2）培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养、起始材料的选择。

    3）培养技术：固定化培养技术、两相培养技术、两步法培养（第1步细胞生长；第2步产物积累）、毛状根培养技术、冠瘿培养技术、反义技术）。

6、植物细胞生物反应器（Plant cell bioreactor）是指用于植物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。要求：具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。

根据大规模培养方法主要分为悬浮培养生物反应器和固定化培养生物反应器两种。

7、初级代谢产物（Primary metabolites）是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。    

8、次级代谢产物（Secondary metabolites） 是通过次级代谢合成的产物，是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。

9、植物细胞大规模培养生产次生代谢物的基本程序：（1）诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系；（2）筛选高产细胞系(株)；（3）在生物反应器中进行大规模培养，获得所需次生代谢物；

10、细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。

11、细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株(Substrain)。

12、前体（precursor ）：指某一代谢中间体的前一阶段的物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。

7.什么是悬浮细胞培养?固定化培养?

答：细胞悬浮培养法：指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。

与固体培养相比。悬浮培养的主要优点是增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营养供应，

避免有毒代谢产物的聚集，保证氧气的充分供应等。悬浮细胞培养的类型有：成批培养、连

续培养和半连续培养。

细胞固定化：指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流

动状态，进行无菌培养的一种技术。包括包埋法和吸附法。

细胞固定化具有以下意义（优点）

1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。

2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。

3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。

4）有利于进行连续培养和生物转化。

8.植物细胞大规模培养体系的建立程序是怎样的?

答：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系→筛选高产细胞系(株)→在生物反应器

中进行大规模培养，获得所需次生代谢物