高中生物选修一专题----DNA粗提取和鉴定

广州执信中学  刘立翔编制

 

     考纲要求：

     ⑴DNA的粗提取与鉴定（在选修三的考纲，具体内容在选修一p54）     

     例1（2007年广东高考题，选修三现代生物科技专题）在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值，该基因可以从这些鱼的DNA中扩增得到。试述在提取和纯化DNA时影响提纯效果的因素及其依据。（列举两点）

    ㈠提取DNA的基本思路和方法：去除杂质（尤其是蛋白质），纯化DNA。

    分析：⑴利用DNA在不同浓度的NaCl下的溶解度与蛋白质等物质不同来去除杂质。在0.14mol/L的NaCl溶液中，DNA不溶，蛋白质溶解，可除去溶液中的杂质；在2或0.015mol/L的NaCl溶液中，DNA充分溶解，可除去不溶的杂质。

    ⑵利用蛋白酶可以水解蛋白质，不水解DNA的原理，可以加入嫩肉粉分离蛋白质。

    ⑶利用蛋白质一般在60℃变性失活，DNA在80℃以上才变性，可以调节适度的温度，并淘汰变性物质，从而分离纯化DNA。

    ⑷利用DNA高度不溶酒精的特性，用酒精溶液析出DNA。

    ⑸利用洗涤剂（以及洗发香波、沐浴液）能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响，所以可以用于提取DNA（多用于植物细胞DNA的提取）。

    例1参考答案．①选择NaCl溶液的合适浓度，利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中溶解度不同的特性，达到分离目的；②加入一定量酒精，使部分蛋白质杂质溶解于酒精，与DNA分离；③加入蛋白酶，除去蛋白质杂质的干扰；④控制DNA提取的温度，使大多数蛋白质杂质变性。

    ㈡鉴定中，可用二苯胺（沸水浴）鉴别DNA，这是因为DNA中含嘌呤的脱氧核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。二苯胺法鉴定DNA，鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。

    除用二苯胺法鉴定DNA的方法外，还可以采用电泳法、紫外灯照射法等方法鉴定DNA。

    ㈢提取DNA实验的材料用具：

    选用鸡血做为实验材料，是因为鸡的血红细胞、白细胞都有细胞核，且细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。实验不能用哺乳动物的红细胞，因为成熟的哺乳动物红细胞没有核。实验用鸡血材料可以到市场售活鸡处索取，所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。（方法：取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液100 mL，置于500 mL烧杯中，注入新鲜的鸡血约180 mL，同时用玻璃棒搅拌，以免血液凝结）。

    将含血液的烧杯置于冰箱内，静置1 d，使血细胞自行沉淀或将血液倒入离心管进行离心，用2 000 r/min或3 000 r/min的转速，离心2 min，使血细胞沉淀于离心管底部，这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液，这样可以获得较多的血细胞。

    由于DNA容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

    ㈣DNA提取的方法步骤有8：

    ①提取鸡血细胞的细胞核物质；②溶解细胞核内的DNA；

    ③析出含DNA的粘稠物；④滤出含DNA的粘稠物；

    ⑤将DNA的粘稠物再溶解；⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液；

    ⑦提取含杂质较少的DNA；⑧DNA的鉴定。

    ㈤实验的方法步骤的比较分析：

    ⑴获取鸡血细胞核物质是利用渗透作用原理，获得较多DNA的关键是向鸡血细胞液中加足量的蒸馏水。

    ⑵实验中共有3次过滤（1、4、6）。过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关。其中只有第二次是要用其滤出的黏稠物（含DNA），所以要使用多层纱布。

    ⑶实验中，有多次搅拌(第1、2、3、5、7、8步中有)，其中除8外，其余均要朝一个方向搅拌，在第3、5步中搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部。这样才能保证得到完整的DNA分子。

    ⑷实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂。第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释氯化钠溶液，使其浓度降至0．14mol／L，从而使DNA充分沉淀析出，蛋白质则充分溶解。

    ⑸实验中有三次加入NaCl（2、5、8），第一、二次加入2mol/L的NaCl40ml和20ml，第三次加入0.015mol/L的NaCl5ml。各有什么作用？

    ⑹在步骤7中，必须使用冷酒精(至少5℃以下存放24小时)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷却几分钟，然后缓缓旋转玻璃棒，使DNA缠在棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。

    实验一般要求采用预冷的95％的乙醇，预冷的乙醇溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

    ⑺如果DNA丝状物较少，不易吸附在玻璃棒上DNA的纯化还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿—异丙醇混合液（体积比为24∶1），通过离心将蛋白质及其他杂质除去,取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。

    ⑻在实验过程中的烧杯和试管最好也是塑料制的，因为玻璃制品会使DNA吸附其上面，会减少DNA含量。

    例2．在DNA的粗提取与鉴定实验中，三次加入氯化钠溶液的作用是

    A．第一次是为了让DNA沉淀析出，后两次是溶解已析出的DNA

    B．前两次是为了让DNA沉淀析出，第三次是溶解已析出的DNA

    C．三次都是为了溶解DNA     D．三次都是为了让DNA沉淀析出

    例3．DNA的提取技术：

    ⑴对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA和RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。其中，可利用DNA和蛋白质等成分在不同浓度的       溶液的溶解度不同而溶解或沉淀，此外，利用DNA不溶于      溶液，等等，均可以分离提纯DNA。

此外，根据                可以水解蛋白质，但对DNA没有影响；大多数蛋白质不能忍受的      ℃高温，而DNA在        ℃以上才会变性；洗涤剂能够瓦解         ，但对DNA没有影响，等等，也均可以达到分离DNA的目的。

    ⑵DNA的粗提取和鉴定实验的基本实验步骤有：①实验材料的      ；②       细胞，获取含DNA的滤液；③去除滤液中的         ；④DNA的        和鉴定。

    参考练习：

    1．可用于鉴定蛋白质和DNA试剂分别是：

    A．斐林试剂和碘液          

    B．苏丹Ⅲ和双缩脲剂                                          

    C．双缩脲试剂和二苯胺试剂     

    D．二苯胺试剂和斐林试剂                                      

    2．NaCl的物质的量浓度为什么时，DNA的溶解度最低？

    A．0.12 mol/L    B．0.13 mol/L  

    C．0.14 mol/L    D．0.15 mol/L                                

    3．从细胞核中提取DNA所用的提取液是：

    A．NaCl溶液    B．酒精        C．二苯胺        D．柠檬酸钠

    4．通过“DNA的粗提取与鉴定”实验，判断以下说法，错误的是：

    A．DNA不溶于酒精溶液     

    B．DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最低                            

    C．提取鸡血中的DNA时，要尽量去掉上清液                                       

    D．DNA遇二苯胺时会染成蓝色

    5．在向溶解DNA的NaCl溶液中不断加入蒸馏水的目的是：

    A．加快溶解DNA的速度                B．加快溶解杂质的速度

    C．减小DNA的溶解度，加快DNA析出

    D．减小杂质的溶解度，加快杂质的析出

    6．在DNA的粗提取的过程中，对增加DNA提取量有影响的的步骤有（多选）：

    A 使血细胞在蒸馏水中充分破裂，充分放出DNA等物质

    B 在滤取含DNA的黏稠物时，要用多层纱布

    C 在析出含DNA的黏稠物时，要缓缓地加入蒸馏水，不可过量

    D 要用冷酒精沉淀DNA，再将混合物放入冰箱中冷却

    参考答案：

    例1．①选择NaCl溶液的合适浓度，利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中溶解度不同的特性，达到分离目的；②加人一定量酒精，使部分蛋白质杂质溶解于酒精，与DNA分离；③加人蛋白酶，除去蛋白质杂质的干扰；④控制DNA提取的温度，使大多数蛋白质杂质变性。

    例2．C            例3． DNA的提取技术：

    ⑴NaCl    酒精    蛋白酶      60-80   80    细胞膜

    ⑵选取    破碎    杂质      析出          

    参考练习：1．C   2．C    3．A    4．D    5 C   6．ABCD