利用PCR-RFLP技术鉴定ABO基因型

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（####班  学好  2011-11-##）

一 引言：

ABO血型是发现最早，应用最广泛的人类血型，ABO血型物质广泛地分布在人体组织和体液中。1990年，Yamamoto等报道了ABO血型系统的糖基转移酶基因序列分析结果，提出了应用PCR扩增和等位基因特异性限制酶消化检测ABO基因型的方法。随后Lee等,Crouse等，Ladd等，Akane等，Herrin等相继报道了ABO基因型测定方法。研究表明ABO基因核苷酸序列具有高度的保守性和同源性，通过分析几个核苷酸的变化就可以确定ABO血型的基因型。 这次我们用Herrin方法，采用两对引物复合扩增ABO糖基转移酶基因中的两个区段，限制酶Kpn I和AIu I同时消化扩增产物，PAGE和银染，获得ABO系统的6种基因型图谱，从而得到毛囊提供者的血的基因型。

二 材料和方法 ：

1材料：

1,1样品：现场从头上拔下几根带有毛囊的头发为检测物质。

1,2引物：P1 P2   ，P3 P4。

2方法：

提取毛囊总DNA后在每一个反应管内同时扩增ABO糖基转移酶基因中两个特异性片段，然后于同一管内进行Kpn I和AIu I限制酶消化，跟限制酶消化前的物质同时做对照，经聚丙烯胺凝胶电泳及银染，给自己ABO基因型分型。

2,1毛囊总DNA的提取及电泳检测步骤：

   带毛囊的头发放进1.5ml离心管，加（0.5mlSTE、50μl 10％SDS、10μl蛋白酶K）55℃水浴消化4-6h 。  加500μl Tris饱和酚离心（12000rpm，5min）。 取上清,加500μlTris饱和酚离心（12000rpm，5min）。  取上清加500μl 25:24:1酚：氯仿：异戊醇离心（12000rpm，5min）。   取上清，加1ml冰异丙醇离心（12000rpm，5min）。  弃上清，加75％乙醇洗涤沉淀离心（12000rpm，10min）。   弃乙醇，晾干沉淀 ,加50μl ddH₂O溶解,0.8％琼脂糖凝胶检测（称0.4g琼脂糖加50ml 1XTBE 加2.5μl 核酸染液。  取5μl总DNA加1μl 6XLoading Buffer点样，150V电泳15min拍照，分析结果看图1）。

2,2糖基转移酶基因片段扩增及电泳检测步骤：

找新离心管加（MIX 12.5μl、ddH₂O 5.5μl、DNA模板1μl、P1/P2:各2μl、P3/P4:各1μl）。   PCR扩增{95℃  5min,(95℃  30s、60.5℃ 20s 、  72℃  45s) 35cycles,72℃ 10min}。  2%的琼脂糖电泳检测点样，125 V电泳40min。（看图2结果）

2,3扩增片段限制性酶切及电泳检测步骤:

PCR产物10μl加{内切酶(KpnⅠ、AluⅠ)：各1μl、缓冲液：2μl 、H2O:  6μl}。     37℃，水浴3h。   加入2ul的10×Loading buffer 终止反应。 10%聚丙烯酰胺凝胶检测300V,2h。     用染色液染色15 min，加显影液，再加终止液。拍照，分析结果（看结果图3）。

三 结果与讨论：

1结果：

6种基因型谱带清晰分型明确。6种基因型的复合扩增产物均由200(199)bp和159bp两条带组成。但经酶切消化后共出现4种特异型片段长度：片段1为200(199)bp、片段2为171bp、片段3为159bp、片段4为118bp。6种基因型判定：片段1+3为AA型，片段1+2+3为AO型，片段1+3+4为AB型，片段1+4为BB型，片段1+2+3+4为BO型，片段2+3为OO型。

图1；倒数第四个是我的毛囊总DNA的提取液0.8％琼脂糖凝胶检测结果

图2；第八个片段是我的糖基转移酶基因片段扩增后电泳检测结果

2讨论：

Yamamato等从不同ABO型别的结肠癌患者的细胞株SW948、SW48、COLO205和SW1417中提取poly(A)-RNA，与λgt10构建4个cDNA文库。经过筛选、测序后发现A基因和B基因之间有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。而O基因在靠近N端出现258G单碱基缺失，形成移码变异，编码出无糖基转移酶活性的蛋白质。其后作者又研究了14例具不同ABO型个体的血样和细胞株，确定A、B基因之间的3个单碱基替换以及O基因258G缺失形成的等位基因特异性限制酶识别位点。

我们选择的2个特异性限制酶识别点为G700A和258G缺失。引物1和2扩增片段200(199)bp，包含258位碱基。A、B基因扩增片段200bp，O基因扩增片段199bp，因O基因258G缺失构成Kpn Ⅰ识别点，酶切后为171bp和28bp，故171bp片段出现则说明有O基因。引物3和4扩增片段159bp，包含700位碱基，A、O基因均为700G，仅B基因为700A，构成Alu Ⅰ识别点，酶切后产生118bp和41bp，所以118bp片段出现说明有B基因。我们选择方法的特点是在同一反应管里复合扩增2条特异性片段，扩增产物同时用2种限制酶消化，操作比较简单，且能节约模板DNA量。125例血样基因型检测与血清学检测结果全部吻合，证实本法分型稳定，重复性良好。电泳分离改用PAGE，经银染显示结果，提高了检测灵敏度，分型结果可长期保存。

表1；  基因型谱带

     基因型测定能够鉴别BB和BO型，AA和AO型，因此法医学个体识别能力应高于血清学检测，依本次调查结果计算，Dp值为0.7536，略高于常规血型测定。基因型分型检测材料是基因组DNA，法医学个体识别应用范围广泛，如ABO非分泌型的体液斑痕，提取其中体细胞DNA，则可鉴定其ABO基因型。复合PCR-RFLP技术为法医学ABO型鉴定提供一新的方法。分型测定中，限制酶液宜新鲜配制，低温保存备用。研究中我们发现反复冻融可使限制酶活性下降，使酶消化不完全，OO型出现未消化完的199bp片段而误判为AO型；BB型出现159bp被误判为AB型。因此在实际应用时建议设置已知O型和BB型血样作对照，可避免因酶活性下降造成的误判。其次，限制酶工作液应低温保存，使用时间不超过1周为好。

四 结论：

我的ABO基因型为 BO。因为从图一看出跟未切割样品谱200bp和159bp对照会发现我的ABO基因型谱中还有171bp和118bp，共四个可见片段。