总结自丁香园：

    双荧光素酶报告基因

    http://meeting.dxy.cn/luciferase/article/i10153.html

    活体动物分子成像技术的组合运用在新药研究中的应用

    http://pharm.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/12999898_1.html

1.什么是荧光素酶检测系统（Luciferase Assay System）？如何使用荧光素酶报告基因载体？
将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。1986年萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得广泛的应用。在荧光素酶的催化下，虫荧光素被氧化并释放一个光子。可用荧光检测仪（比如，Turner DesignsTD-20/20, Promega公司目录号E2041）及液闪计数仪对荧光作定量测定。荧光素酶报告基因载体用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，可对启动子及增强子序列作快速及方便的分析。pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。具体情况如下：
pGL2-及pGL3-Basic载体不含启动子及增强子，将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游，可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。
pGL2-及pGL3-Promoter载体含SV40的启动子可驱动荧光素酶基因表达。插入可能的增强子可增加荧光素酶基因的表达。
pGL2-及pGL3-Enhancer载体在荧光素酶基因下游插入了SV40的增强子，这可用于测定能增强荧光素酶基因表达的启动子。
pGL2-及pGL3-Control载体含SV40的启动子及增强子，能产生高水平的荧光素酶基因表达。可作为检测转染频率的有效对照。

2.荧光素酶报告基因与其他分子相比有哪些优点？
优点包括：
荧光素酶检测系统是非放射性。
比氯霉素乙酰转移酶检测系统（CAT）及其他报告基因系统更快。
荧光素酶检测系统比CAT灵敏100倍。
荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3.5小时。由于半衰期短，故启动子力的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。
荧光素酶浓度在10-16M（10pg/L）到10-8M（1mg/L）范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到10-20摩尔的荧光素酶。

3.Promega公司的荧光素酶检测系统与其他常用的荧光素酶检测系统相比如何？
Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法，灵敏及简单，产生的光稳定，可参考Promega Notes 54, 20 (1995),Jones D P, Sherf B A , Wood K V对荧光素酶检测系统所作的比较。

4.pGL3荧光素酶报告基因载体与pGL2荧光素酶报告基因载体有何区别？
pGL3荧光素酶报告基因载体在设计上含有许多改进。改进细节可见pGL3荧光素酶报告基因载体技术手册TM033。对荧光素酶报告基因编码序列所作的改变见pSP-luc+载体技术手册TB208。这些变化可增强荧光素酶检测系统的灵敏度，有利于载体的使用，降低质粒与细胞因子的意外结合。具体而言：
替换了C-端的氨基酸，使荧光素酶位于胞质内，增强荧光素酶检测系统的信号。
含优化的真核（Kozak）翻译起始序列及改进的密码子编码，增强在动物及植物中的表达。
除去两个N—糖基化位点。
在DNA序列上作了很多改变，消除了荧光素酶编码区内长的回文结构及常用的限制性内切酶位点。

5.报告基因裂解液与细胞培养裂解试剂间有何区别？
报告基因裂解液使荧光素酶，β-半乳糖苷酶，CAT报告基因酶能从共转染实验所得的同一抽提物中，进行酶活力的测定。用细胞培养裂解试剂制备的抽提液适用于荧光素酶检测系统，与β-半乳糖苷酶，或CAT报告基因酶测试系统不相容。

7.用冻融法制备的细胞裂解物能用于荧光素酶检测系统吗？
应避免使用冻融法制备抽提物，多轮冻融会极大降低荧光素酶活性，降低的程度随细胞株而变。用报告基因裂解液制备抽提物时，单次冻融有助于细胞裂解。但有些研究人员发现单次冻融所得的抽提物会使荧光素酶活性升高。

8.用荧光检测仪作荧光素酶检测时需用自动加样系统吗？
不需用自动加样系统。普通的荧光素酶检测系统产生光闪烁，在酶与底物混合后很快地衰减。Promega公司的荧光素酶检测系统荧光素酶的酶活性高，产生的光的强度高，在测试的几分钟内可保持稳定。

9.液闪计数仪能用于荧光素酶检测吗？
液闪计数仪作一些改变后，可测定荧光素酶活性。读数时需对样品作大的稀释（用含1mg/mlBSA的1×报告基因裂解液或1×细胞培养裂解试剂）
将样品直接放入透明或半透明的测试瓶中，应完全覆盖瓶底。不能加闪烁液。另外，也可将样品放在小离心管中，再放入测试瓶中。
液闪计数仪上的偶合循环应关掉，如不能被关掉，也可通过测量cpm减去背景cpm读数开方，确定荧光素酶读数与cpm的线性关系。可用空白水或非转化细胞抽提物来测定背景cpm。
反应应在读数前立刻进行，每一次读数1-5分钟。液闪计数仪用手动测定。

10.为什么需要对带有偶合循环的液闪计数仪的结果作调整？
从荧光素酶测试反应中所释放的光子，撞击光扩增管的概率与反应中荧光素酶的浓度成正比。如液闪计数仪的偶合循环在运行，则光子需同时撞击两个光扩增管才能被液闪计数仪记录。而两个独立事件（光子释放和撞击PMT）同时发生的概率是两个事件单独发生概率的乘积。因荧光素酶反应所释放的任一个光子撞击PMT的概率相同，则两个光子撞击两个PMT的概率等于一个光子撞击一个PMT的概率开方。取cpm的开方，则可将液闪计数仪的读数cpm正比于酶浓度。

11.荧光素酶检测系统需要制备标准曲线吗？Promega公司提供纯化的荧光素酶吗？
不需作标准曲线。荧光素酶检测系统用于比较样品的相对活性。如需作标准曲线，则需从非转染的细胞所得提取物作稀释以校正抽提物对测试的影响。通过标准曲线，则荧光素酶的量与光的测量值相关联。可从Promega公司购得纯化的荧光素酶（E1701，E1702），作标准曲线。

12.荧光素酶基因转录物的长度是多少？
克隆序列决定实验所得转录产物的长度。从荧光素酶报告基因对照载体所得的荧光素酶基因转录产物的长度为2650nt。从pGL2对照载体所得转录产物的长度是2720 nt，这是非加工的转录产物的长度。

13.荧光素酶蛋白的长度是多少？
荧光素酶蛋白单体的分子量为62kDa。

14.有荧光素酶的抗体吗？
可从Promega公司购得抗荧光素酶的抗体（目录号G7451）。

15.用报告基因裂解液与细胞培养裂解试剂制备的细胞裂解物能作蛋白浓度测定吗？
用报告基因裂解液与细胞培养裂解试剂制备的细胞裂解物，可用一种兼容去污剂的蛋白测试方法确定其浓度。比如可用Bio-Rad DC蛋白测试方法(Bio-Rad 目录号500-0116)或用Pierce BCA蛋白测试方法(Pierce目录号23225)。用细胞培养裂解试剂制备的细胞裂解物因含DTT需作稀释。

    检测的是细胞因子的启动子。换句话说，是细胞因子的启动子融合的报告基因被转染到细胞内，通过刺进因素作用后，检测启动子的表达情况。这个是背景。利用双荧光素酶报告基因系统
同时转入内参质粒,可除转染效率不同的孔和细胞之间的差别。

    基因敲除载体，像我做原核基因的，这种载体一般是自杀性质粒构建的，这样才能和目的菌发生同源重组，进而进行敲出；克隆载体一般是用于测序的，比如说常规的T载体，用于TA克隆，一般是用于测序或是中间进行转化；表达载体常用的就是蛋白表达载体，经典的就是PET系列的载体和其他一些酵母（病毒，昆虫）对应的表达载体，不知道用于RNAi的属不属于表达载体；报告载体，顾名思义，肯定是载体上要有报告基因了，常见的是半乳糖甘酶，绿色荧光蛋白，荧光素酶。想这几种载体的话，比较大的公司都有