（1）变性时间是如何确定的？

在选择的变性温度下，DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。如果变性温度过低或时间太短，模板DNA中往往只有富含AT的区域被变性。

在PCR的第一个循环中，有时常把变性时间设计为5 min，来增加大分子模板DNA彻底变性的概率，又称此为预变性。当模板DNA的G+C含量超过55%时，

需要更高的变性温度，来源于古细菌的DNA聚合酶比TaqDNA聚合酶更能耐受高温，因此更适合用来扩增富含GC的DNA模板。

（2）复性温度的确定有什么考虑？

复性过程（即退火）采用的温度至关重要。如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好地复性，扩增效率将会非常低。如果复性温度太低，引

物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。

（3）延伸的时间是如何确定的？

Taq DNA聚合酶在最适反应温度（72～78 ℃）下聚合速率约为2 000 bp/min。根据多数研究者的经验，确定了一个规则，即：靶基因的每1 000 bp的

扩增产物的延伸时间被设计为1 min，以此类推。对于PCR的最后一个循环，许多研究者常把延伸时间增加为以前循环的延伸时间的3倍以上，以使所有

扩增产物完成延伸，这又称为后延伸。

（4）循环数目一般都为30，这个数值是怎么来的？

PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的速率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，

直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物低到难以检测的程度。用

TaqDNA聚合酶在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。