目的基因和目的基因自连，质粒和质粒自连，都是可能发生的。目的基因自连后形成无抗性的环状物，经转化后在抗性平板上不生长；质粒与质粒自连后带有抗性基因，转化后可能生长，但是质粒链较长，连接效率低。为了进一步减少自连现象，可以用较高的目的基因:质粒比例；也可以用 CIAP或者 SAP 之类的碱性磷酸酶对质粒做去磷酸化处理，去磷酸化之后的DNA不能自连，只能和未去磷酸化的DNA相连，几乎完全消除了质粒自连的可能。