1、细胞固定的方法

    所谓细胞固定，就是用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。

    固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。

    在细胞涂片制片过程中，迅速固定是非常关键的一步，关系到能否对这些细胞做出正确的判断。这包含了二方面的意思：一是尽可能的保证送检标本的新鲜，二是制片完成后要迅速的固定。相对后者，保证送检标本的新鲜显得并不十分重要，就个人经验而言，一般标本（除针吸细胞需立即制片外）在室温下8小时内处理，细胞褪变并不十分明显；真正引起细胞褪变的是制片时，细胞在干燥过程中氧化所引起，也就是说，快速的湿片固定是制片的关键。一张合格的细胞涂片，必须能够清楚的看到细胞的核膜、核仁、染色质和完整的细胞形态与结构。

    （1）.湿固定法：将细胞标本制作完成后，在细胞湿润时，立即放入以醇性溶液为主的固定液（95%酒精、无水酒精、甲醇、乙醚酒精液等）内，称湿固定法。这种方法是目前最好的固定方法，可以完好的保存细胞内的各种结构，对正确认识各种细胞的性质，减少细胞学的误诊有很大的帮助。

    细胞经过湿固定后，应该直接从固定液内拿出放入染色液中，无需水洗或干燥，水洗容易使细胞脱落，干燥会导致细胞褪变，也就是说无论在固定前还是固定后细胞干燥都会导致细胞褪变。湿固定后的固定液，一定要过滤或更换，防止细胞的脱落和污染。

    （2).干固定法：将细胞标本制作完成后，干燥（自然或加热）后再放入固定液内。这个方法只适用于有特殊要求（如姬姆萨和瑞氏染色），或者在湿片制作过程中由于细胞量太少，玻璃片上水分过多，而又没有可以重新制作的标本量时，作为一种补救的方法。自然干燥的涂片细胞高度肿胀，核结构不清，似毛玻璃样；而加温干燥的细胞涂片如水分较少，和自然干燥的涂片相同，但如果水分较多，细胞会严重收缩，核浆深染，看不清结构。

    (3).喷雾固定法：此方法为湿固定法的改良，在涂片制成后，将涂片平放，把固定液（含有酒精和油性物质或甲基化合物的混合物）喷洒在涂片上，静置至干燥，并在细胞表面形成一层薄膜，染色前需放入水中浸泡10min。

    (4).液基细胞学的固定方法：与湿固定法原理相同，只是先将各种细胞标本放入液基细胞的固定液（各厂家产品不尽相同，以酒精与甲醇为主要成份）内固定后，再经过机器或手工将细胞转移至玻璃片上，并将制好的涂片立即放入95%酒精内固定、染色，其效果与湿固定相同。

2.常用细胞固定剂及其性能

    （1）.95%酒精：最常用的细胞学固定液，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋沉淀后，能溶于水，因此，经95%酒精固定的涂片，染色前没有必要经过水洗。此固定液适用于苏木素-伊红染色和巴氏染色。固定时间根据标本的不同，时间也不尽相同，一般标本固定时间为15-30分钟，痰标本需要更长一些时间。经过95%酒精固定的标本，细胞核保存较好，结构清晰，颜色鲜艳。如果在95%酒精液内加入聚乙二醇更佳，可以保护细胞免受空气干燥后的人工假象。   

    （2）.乙醚酒精液（1：1)：其效果与95%酒精相似，但由于乙醚有很强的吸水性和特有的刺激性气味，容易挥发，长期低浓度吸入，有头痛、头晕、疲倦、嗜睡、蛋白尿、红细胞增多等不良反应。长期皮肤接触，可发生皮肤干燥、皲裂。所以现在已经逐渐被95%酒精所代替。

    （3）.甲醇：固定时间快，细胞收缩小，细胞核保存较好，结构清晰，染色鲜艳。常作为穿刺细胞涂片的固定液。对抗原保存较好，可作为细胞涂片免疫组化的固定液。缺点是具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对中枢神经有一定的伤害。甲醇的毒性与其代谢产物甲醛和甲酸的蓄积有关。以前认为毒性作用主要为甲醛所致, 甲醛能抑制视网膜的氧化磷酸化过程,使膜内不能合成ATP,细胞发生变性,最后引起视神经萎缩。近年研究表明,甲醛很快代谢成甲酸,急性中毒引起的代谢性酸中毒和眼部损害，主要与甲酸含量相关。

    （4）.冰醋酸：5%水溶液可作固定用。不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白。渗透性强，固定快，能使红细胞膨胀而破碎，常与其它液体配合使用。   

    （5）.无水酒精：对糖原保存较好，容易使细胞收缩，其性能与95%酒精相似，很少单独使用，一般只用于糖原的固定。

    （6）.丙酮：为易挥发的无色液体，有刺激性气体。可使蛋白质沉淀，渗透性强，细胞收缩严重，对核的固定差。很少用于常规细胞学的固定。广泛用于酶组织化学中的各种酶的固定，也有人用于抗原的保存，作为细胞涂片免疫组化的固定液。丙酮具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。

    （7）.Carnoy 固定液:无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。Carnoy液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常用于糖原及尼氏体的固定，由于冰醋酸能溶解红细胞并可防止细胞由酒精引起的过渡收缩，对固定有血的标本和显示DNA、RNA效果很好。缺点是每次固定后固定液内有大量的红细胞碎片和细胞脱落，必须及时过滤，否则容易造成污染。其次，氯仿具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。

    (8).10%中性缓冲甲醛液：固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g。10%中性缓冲甲醛液对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩较小。但此液体不适合固定湿固定的涂片，可作为干固定涂片和细胞蜡块的固定液。甲醛也具有挥发性和毒性。大量吸入会出现呼吸道的严重刺激和水肿、眼刺痛、头痛，也可发生支气管哮喘。经常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出现粘膜充血、皮肤刺激症、过敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛等。全身症状有头痛、乏力、胃纳差、心悸、失眠、体重减轻以及植物神经紊乱等。

                                                               昕-2008   my@biology