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Northern杂交

(2011-12-08 10:57:12)
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杂谈

 

Northern 杂交(Northern blotting)是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术,首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上,再与放射性标记的探针杂交,通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。1979年,J. C. Alwine等提出将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上,通过共价交联作用使它们结合,因其方法同Southern杂交十分相似,故称之为Northern杂交。

Northern 杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法,可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括:①完整mRNA的分离;②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离;③将RNA 转移到固相支持物上,在转移的过程中,要保持RNA 在凝胶中的相对分布;④将RNA固定到支持物上;⑤固相RNA与探针分子杂交;⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子;⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。

Northern杂交与Southern杂交相比,被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳3种。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。另外前者的条件要严格些,特别是RNA容易降解,前期制备和转膜过程易受RNase污染,要获得较好结果,需用稳定性最差的mRNA与DNA进行杂交,对实验条件要求严格;然而有些应用中Northern杂交避免用复杂探针筛选cDNA文库的繁琐。

 Northern杂交技术应用于特定性状基因在mRNA水平上的动态表达研究。如应用于定位克隆中寻找新基因,寻找染色体特定区域的表达序列使大多数人类遗传疾病连锁分析和定位克隆的主要限速步骤,Northern杂交作为寻找这些序列的有效方法,有助于这些疾病候选基因的筛选。

 

(From:http://liu3305602.blog.163.com/blog/static/1485465320071269263437/)

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