Northern杂交
(2011-12-08 10:57:12)
标签:
杂谈 |
Northern 杂交(Northern blotting)是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术,首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上,再与放射性标记的探针杂交,通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。1979年,J. C. Alwine等提出将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上,通过共价交联作用使它们结合,因其方法同Southern杂交十分相似,故称之为Northern杂交。
Northern 杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法,可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括:①完整mRNA的分离;②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离;③将RNA 转移到固相支持物上,在转移的过程中,要保持RNA 在凝胶中的相对分布;④将RNA固定到支持物上;⑤固相RNA与探针分子杂交;⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子;⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。
Northern杂交与Southern杂交相比,被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳3种。电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。另外前者的条件要严格些,特别是RNA容易降解,前期制备和转膜过程易受RNase污染,要获得较好结果,需用稳定性最差的mRNA与DNA进行杂交,对实验条件要求严格;然而有些应用中Northern杂交避免用复杂探针筛选cDNA文库的繁琐。
(From:http://liu3305602.blog.163.com/blog/static/1485465320071269263437/)