多肽合成的常见问题

问：多肽的两端应如何处理？是保持自由状态还是屏蔽起来？ 
答：多肽是用来模拟蛋白的，为了模仿蛋白的表现，我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后，两端的电荷数将与基因体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。 总体而言： 如果是出自蛋白C端的序列，通过乙酰化将N端屏蔽； 如果是出自蛋白N端的序列，通过酰胺化将C端屏蔽； 如果是出自蛋白中间部分，用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。 

问：如果我的肽纯度是95%，那么，其余的5%都是些什么物质？ 
答：多肽的纯度通常是通过HPLC，用每分钟1%的标准乙晴梯度来检测决定的。合成过程中，氨基酸之间的交联效率不是总能达到100%，因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了，但有少数的杂质其色谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样品中就构成了余下的几个百分点。

问：如何重新溶解多肽？ 
答：多肽的溶解与多肽的序列相关，首先试蒸馏水和超声（1-10MG/ML），如果不溶，计算肽中的碱性残基（Lys,Arg,His和自由氨基端）和酸性残基（Gly,Asp和自由羧基端）的数目。如果碱性基团偏多，可以滴加1N的醋酸，直到溶解为止，如果酸性基团居多，滴加1N的氨水，直到溶解为止。如果在实验中需要用缓冲液，建议在多肽完全溶解之前不要加入盐，因为盐会使肽的溶解度降低。如果上述溶液中肽都不溶，可以试试用少量有机溶剂如DMSO，乙晴或DMF。

问：什么是多肽的净含量，它的意义是什么？ 
答：干品多肽的重量中不仅仅包含多肽，还包含有一些非肽的组份，如水，被吸收的溶剂、配位离子和盐等。肽的净含量是指肽在其中的重量百分比，这个百分比的数值范围很大，可能从50%到90%，取决于纯度、序列以及合成和纯化的方法，不要将肽的净含量和肽的纯度混为一谈，它们是完全不同的两个概念。纯度通常是由HPLC决定的。纯度定义的是多肽样品中含正确序列的组分的百分比，而肽的净含量是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比，肽的净含量通常是用氨基酸组分分析或紫外分光法测定的。这个信息主要是在一些对肽的浓度很敏感的实验中，对计算肽的浓度是很重要的。

问：对不同的实验，如何选择肽的纯度？ 
答：肽的纯度是很重要的指标，纯度的选择取决于实验的目的。对不太灵敏的筛选实验，建议使用粗品或>75%，对免疫级别，建议选用>85%。对于受体与LIGAND相互作用的研究，生物ASSAY研究，或细胞水平的研究，建议>95%，对于结构研究，建议>98%。  

问：如何保存多肽？ 
答：在可能的情况下，应该尽量将多肽以冻干粉的形式在-20℃下保存，这样会在几年内避免细菌的降解，二级结构的形成、氧化或其他修饰的发生。多肽在溶液中的稳定性要差一些，所以强烈建议使用灭菌水或灭菌过滤的方式进行溶解，如果序列中有Cys,Met或Trp等残基，用无氧的溶剂进行溶解以避免氧化。使用冷冻的溶液时，建议将溶液进行分装，以避免多次的溶解和冷冻对多肽造成的损害。pH的推荐范围是3-6之间。使用前应保证包装容器和所装物品回温到室温，以避免吸水。多肽溶液最好即配即用，使用过程中将肽溶液保持在低温但不结冻的状态下。长期保存（3个月到5年）：冻干粉，在-20℃下冷冻干燥保存；中期保存（0-3个月）：-20℃冷冻液体或冻干粉冷藏；短期保存（<1周）：冷藏的液体或冻干粉。 

 
问：常见的是用什么方法生产多肽？ 
答：线性多肽肽链的延伸采用Fmoc固相合成法，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢吡啶将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接了上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接完毕后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品

1.多肽合成的基本原理?
多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的最大特点是不必纯化中间产物，合成过程可以连续进行，进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成，基本都是固相合成。其基本过程如下：
基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同，多肽后处理方式不同，纯化方式也有差异。

2.做免疫用的多肽多长为合适?
答：一般约10-15个氨基酸，当然长一些免疫效果好一些，不过合成费用也会增加。MAP多肽则希望长度在15aa以上，效果较好。另外，10aa以下的多肽免疫效果比较差。

3.免疫用多肽的纯度需要很高吗?
答：一般而言， 免疫用Peptide，70-85%即可。

4.我们合成的多肽溶解性不好，多肽就有问题对吗?
答：很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题这个观念并不正确。

5.多肽状态是如何?如何保存储存?
答：我们提供的多肽是粉末状，一般为灰白色，组成不同，多肽粉末的颜色有差异，多肽一般长期保存需要避光保存，并应保存在-20度，短期可以保存在4度。可以短时间的话是以室温运输。

6.如何溶解多肽?
答：溶解多肽是非常复杂的事情，一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试验，在没有确定合适的溶剂前千万不要合部溶解。
下列方法有助于您选择合适的溶剂：
(1)判定多肽的电荷特定，设定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1；碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其它氨基酸的电荷为0。计算出将电荷数。
(2)如果净电荷数 >0，多肽为碱性，用水溶解：如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸(10%以上)；如果多肽还不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。
(3)如果净电荷数<0，多肽为酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。
(4)如果净电荷数=0，多肽为中性，一般需要用有机溶剂如乙腈，甲醇或异丙醇，DMSO等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。

7.非HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?
答：粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质：如非全长多肽和多肽后处理的一些原料如DTT、TFA等

8.HPLC纯化的多肽有哪些杂质?
答：经过HPLC纯化的多肽，仍会有一些一些杂质存在，其中的杂质主要是短肽和微量TFA。

9.多长的多肽为合适?
答：多肽合成需要考虑多肽的长度，电荷，亲疏水性等因素。长度越长，合成粗品的纯度和产率都随着降低，纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的，但是为了多肽的顺利合成，有时不得不在功能取的上下游增加一些辅助氨基酸，以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短，合成也可能有问题，主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。

10.如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?
(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽很难溶解与水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成，都有可能有问题。
(2)一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%，不能连续5个连续aa为疏水性，带电荷的氨基酸的(正电荷K,R,H,N-terminus,负电荷D,E,C- terminus)的比例达到20%，在多肽的N或C短如果能增加极性氨基酸，也可以改善溶解性。

11.为什么含有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?
答：含有Cys, Met,或Trp的多肽难以合成，同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定，易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意，避免反复开启盖子。

12.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?
答：多肽合成与引子合成有比较大的区别，不能合成的引子很少，但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这些氨基酸比邻或重复时，多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。以下几种情形，合成效率和产物的纯度都比较低，如：重复Pro,Ser-Ser，重复Asp，4个连续Gly等.

13.多肽是如何纯化的?
答：多肽纯化一般使用反相柱(如C8，C18等)，214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂，pH 2.0 。Buffer A为含0.1%TFA in ddH2O，Buffer B为1%TFA/ACN/ pH 2.0。纯化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用Buffer B溶解后，然后用Buffer A稀释；对疏水性强的多肽，有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗产物，如果多肽不长(15aa以下)，一般会有主峰，主峰通常为全长产物；对于20aa以上的长肽，如果没有主峰，HPLC需搭配Mass来判定分子量，进而确定哪个峰是所要合成的多肽