实验目的

熟练掌握培养基(RPMIl640和DMEM)的配制，了解其他培养基的配制方法。

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　　组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10％。20％)。

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***材料：3 000 mL锥形瓶，250 mL或500 mL培液瓶，翻帽塞，饭盒，pH试纸，孔径0．22 μm的微孔滤膜。

***药品： 盐酸，无离子水，小牛血清，合成培养基(RPMI1640或DMEM)，青霉素，链霉素，NaHC0₃。

***仪器(请参看仪器图库)： 滤泵(进口)1套，滤器(进口)1套，蒸馏器，高压灭菌锅，磁力搅拌器。

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(一)准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0．22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。 过滤后要检查滤膜是否完好无损。

(二)合成培养基的配制

1．去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏(去除无机和有机杂质)，制3 000 mL三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理(15磅20 min)。

2．待水温降至15—30℃C，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间(2—4 h)使之充分溶解。

3．配制RPMll640培养基时应通入适量C02或加入6 mol／L盐酸调pH至6．0左右，这样才能充分溶解。

4．加入一定量NaHCO，调节pH至7．0左右。

5．加水至最终体积。

6．在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。

7．瓶口封好，4℃冰箱贮存(RPMI1640培养基可以-20℃贮存)。

(三)小牛血清的处理 市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。

1．将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。

2．处理后的血清贮存于4℃。

3．小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量(见八、新生牛血清的筛选)。

(四)生长培养基的配制 除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌素。

1．培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。

2．按如下比例配制： 基本培养基占80％－90％，小牛血清占10％－20％。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL,。

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根据表2—3—4的实验安排进行实验，实验结果中填写：遇到什么问题?如何解决?实验结果怎样?

表2—3—4培养基的配制 　 　　　

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1．培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。因为用于处理提取RNA的DEPC水(0．1％焦炭酸二乙酯)是一种致癌剂，并可能影响细胞生长；而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。

2．过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3．5次用完为宜，并且每瓶只能装2／3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。

3。滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。

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1.为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理?

2．血清在细胞培养中有何作用?

3．配制培养基时调节pH值的目的是什么?