加载中…流式细胞仪检测细胞凋亡方法(Annexin V 法)
(2012-10-19 09:06:12)
标签：
健康生物技术干细胞 |
分类： 生物技术 |
Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料（如PI或7-AAD）合并使用，来区分凋亡细胞（Annexin V+/核酸染料-）与死亡细胞（Annexin V+/核酸染料+）。
1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
5. Annexin V试剂与核酸染料：
|
Annexin
V |
核酸染料 |
|
Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X） |
PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） |
|
Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） |
7-AAD（Cat. No. 34321X） |
|
Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X） |
PI（Cat. No. 66211E） |
|
Annexin V-PE（Cat. No. 65875X） |
7-AAD（Cat. No. 34321X） |
6. FACS流式细胞仪：上样检测。
7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。
8. Annexin V检测对照管：
|
A-阴性对照 |
B-补偿1 |
C-补偿2 |
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Biotin |
SAv-FITC |
Annexin V-Biotin和SAv-FITC |
PI和SAv-FITC |
|
PE |
未染色细胞 |
Annexin V-PE |
7-AAD |
|
FITC |
未染色细胞 |
Annexin V-FITC |
|
2. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1× Binding Buffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。
3. Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。
4. 按以下体积加入Annexin V与核酸染料：
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名称 |
荧光标记Annexin V |
核酸染料 |
|
|
1 |
阴性对照 |
— |
— |
|
2 |
单阳1 |
AV-FITC |
— |
|
3 |
单阳2 |
— |
PI |
|
4 |
样本 |
AV-FITC |
PI |
5. 轻轻混匀，室温（20°C ~25°C）避光处放置15分钟。
6. 使用Annexin V-Biotin试剂进行检测时：
1×Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
1×Binding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。
轻轻混匀。
加入5μl PI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。
7. 各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μl。
8. 1小时内上流式细胞仪测定结果。
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