RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。

与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD 而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处，它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、还是由缺失、插入造成的。

DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段(Southern杂交)和结果分析。

基因组 DNA 大于50kb，分别来自不同的材料。

电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜依胶大小而定)，滤纸，eppendorf管0。5ml)若干。

1. 限制性内切酶(BamHⅠ， EcoRⅠ， HindⅢ， XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。

2. 5×TBE电泳缓冲液。

3. 变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。

4. 中和液：1mol/LTris?Cl， pH7.5/1.5mol/L NaCl 。

5. 10×SSC。

6. 其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl， pH7.5/2×SSC ， ddH₂O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl ，10× transcription buffer，10× nucleotide mix (10mm each ATP GTP CTP)，20U RNase inhibitor，40U T7，T3or SP6 RNA Polymerase，DMPC处理水，DNase I (40U) RNase free，EDTA (0.2M PH 8.0)，RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)。

(一) 基因组 DNA 的酶解

1. 大片断DNA 的提取详见基因组 DNA 提取实验，要求提取的DNA 分子量大于50kb， 没有降解。

2. 在50μl反应体系中，进行酶切反应：

5μg基因组 DNA 、 5μl 10×酶切缓冲液 、 20单位(U)限制酶任意一种、 加ddH₂ O， 至50μl 。

3. 轻微振荡， 离心，37℃反应过夜。

4. 取5μl反应液，0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。

[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解， 酶切反应一定要彻底。

(二) Southern转移

1. 酶解的DNA 经0.8％琼脂糖凝胶电泳可18V过夜后EB染色观察。 　　

2. 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤， 10分钟。 　　

3. 取出胶块， 蒸馏水漂洗， 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。

4. 预先将尼龙膜，滤纸浸入水中，再浸入10×SSC中，将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸桥然后将胶块反转放置，盖上尼龙膜，上覆二层滤纸，再加盖吸水纸，压上半公斤重物，以10×SSC盐溶液吸印，维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。

5. 取下尼龙膜， 0.4mol/L NaOH 30秒， 迅速转至0.2mol/L Tris?Cl，pH7.5/2×SSC，溶液中， 5分钟。

6. 将膜夹于2层滤纸内， 80℃真空干燥2小时。

7. 探针的制备交如下：

(1). 将10ng-3μg 纯化模板DNA，RNase-free 水加到灭菌RNase free 1.5ml 离心管中，体积为15 μl。

(2) 沸水浴10min后快速置于冰上。

(3) 依次加入下列试剂

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(4) 短暂离心，温和混合，37℃保育1-20h。

*注意：过长时间保育不能增加标记RNA产量；仅在RNase保护试验中被要求。

(5) 加65℃温育10min或加入2μl 0.2M EDTA  PH 8.0)终止反应。

(6) 琼脂糖凝胶电泳检测DNA探针长度。

(7) 探针分装保存在-20℃备用

*注意：避免探针反复冻融。

(三) Southern杂交

1. 取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL,1.0%凝胶)

2. 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照
记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。

3. 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)

(1) 将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。

(2) 用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

(3) 将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。

(4) 将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。

(5) 重复上一步。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等。

4. 准备DNA从凝胶向膜转移的平台

5. 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。准备10 X SSC 转移液。

将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。

6. 安装毛细管转移装置

(1) 将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。

(2) 将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。

(3) 将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。

(4) 用保鲜纸封住凝胶四边。

(5) 将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。

(6) 将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。

(7) 转移几小时或过夜(至少4小时)

注意：勿使转移液干枯。

7. 已转移的DNA与膜交联

(1) 将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。

(2) 将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。

(3) 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。

此膜可在40 度长期保存。

8. 印迹的预杂交

将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜，在42℃预杂交30min。

9. 准备探针

水煮地高辛标记的探针5min使变性，并立即放在冰上2min.

10. 加适量的探针到已预热的杂交液中，混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)。42℃杂交至少4小时或过夜。

注意：不要将探针直接加在印迹膜上，而应加在容器一角的预杂交液中

11. 印迹膜的冲洗：

(1) 将杂交液倒出，储存起来可再次使用。

(2) 用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次，每次5min 。

(3) 用已预热的30mL 0.5XSSC，0.1%SDS 在65℃摇动洗膜2次，每次15min (用杂交炉)。

12. 免疫检测

(1) 用10mL冲洗液洗膜1-5min；

(2)  膜在15mL阻断液中孵育30min；

(3)  膜和8mL抗体孵育30min；

(4)  在15mL冲洗液中洗膜2次,每次15min；.

(5)  在15mL检测液中平衡2-5min。

13. 将膜的有DNA的面朝上，放在保鲜纸上，滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜；然后,立即用保鲜纸包裹，挤掉多余的CSPD ready-to-use，使其均匀平铺在膜上，没有气泡，但避免使膜干掉，室温孵育5min.

14. 在37摄氏度孵育潮湿的膜10min，增强发光。

15. 用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min(发光性能至少可持续48小时)。

16. X-光底片的冲洗。

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片。