加载中…原核表达III
(2010-05-31 08:39:40)
标签：
杂谈 |
分类： CSHL |
PartⅣ诱导表达
一、
诱导表达
1.
诱导表达类型
组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。
诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。
分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。
可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高（非常股复杂）。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
2.诱导表达
（1）挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
（2）按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的培养瓶中,
37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3h。
（3）取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），作为实验组,两组继续
37℃震荡培养3h。
（4）分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用PBS重悬、洗涤、离心。
（5）对细菌沉淀进行处理，做SDS-PAGE等分析。
3.注意事项：
（1）关于表达不出来的原因有很多
a如果测序都是正确的话，设计一个postive expression control，验证整个表达系统没问题。
b检测是否有毒性。涂一个IPTG的板子看菌落生长情况如何。
c 看看稀有密码子情况，是不是存在成簇的N端的稀有密码子。
d看看稳定性，上swiss
prot看看在大肠杆菌中的稳定时间是多少。
e如果表达的是真核蛋白，可能问题更复杂，可能涉及到伴侣蛋白等问题？
f 有人会检测mRNA的稳定性。
g可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。因为有时你的目的蛋白表达丰度过低，SDS-PAGE检测不到。
（1）提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
（2）IPTG：IPTG浓度0.2-0.5mM
IPTG足够了，不会降低表达量，反而会增加蛋白的可溶性。IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包涵体）。T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
（3）温度：一般37℃诱导3-4小时，30℃诱导6小时是蛋白表达的最大产量期。22℃、18℃、16℃等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑将温度再降（但表达总量会有所降低），可以考虑25°，诱导8-10个小时；20°诱导14-18个小时；甚至15°24-36小时诱导。
二、
检测诱导表达
1.细菌的裂解裂
常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。
下面介绍酶溶法和超声破碎法结合使用的实验步骤。
（1）常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。4
℃，5000rpm 离心，15
min ，收集诱导表达的细菌培养液（30 mL ）。弃上清，1mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀，30℃作用1h。
（2）超声破碎细菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm
,4 ℃离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，待检测。
注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3
-4 次冻溶后更容易破碎。
2．进行SDS –PAGE检测
（1）表达结果：
a细胞质中表达；b包涵体形式表达。
（2）包涵体的纯化
a包涵体的洗涤；b包涵体的溶解；c包涵体的检测
从基因角度改造一下，如果能够去掉一些疏水区段会很大程度上改善蛋白的可溶性
（4）注意事项
a所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
b根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。具体的序列和说明
c包涵体蛋白溶液保存在四度里，避免反复冻融，否则体系不稳定，蛋白以沉淀析出；胞质蛋白不能在四度放置很久，因为上清中含有很多蛋白酶，会把靶蛋白降解掉。
PartⅣ诱导表达
一、
诱导表达
1.
诱导表达类型
组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。
诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。
分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。
可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高（非常股复杂）。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
2.诱导表达
（1）挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
（2）按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的培养瓶中,
37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3h。
（3）取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），作为实验组,两组继续
37℃震荡培养3h。
（4）分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用PBS重悬、洗涤、离心。
（5）对细菌沉淀进行处理，做SDS-PAGE等分析。
3.注意事项：
（1）关于表达不出来的原因有很多
a如果测序都是正确的话，设计一个postive expression control，验证整个表达系统没问题。
b检测是否有毒性。涂一个IPTG的板子看菌落生长情况如何。
c 看看稀有密码子情况，是不是存在成簇的N端的稀有密码子。
d看看稳定性，上swiss
prot看看在大肠杆菌中的稳定时间是多少。
e如果表达的是真核蛋白，可能问题更复杂，可能涉及到伴侣蛋白等问题？
f 有人会检测mRNA的稳定性。
g可以用亲和层析等办法富集你的目的蛋白，然后再跑胶。因为有时你的目的蛋白表达丰度过低，SDS-PAGE检测不到。
（1）提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
（2）IPTG：IPTG浓度0.2-0.5mM
IPTG足够了，不会降低表达量，反而会增加蛋白的可溶性。IPTG浓度过高，易使蛋白表达速度增大，来不及正确折叠而产生不溶性蛋白（包涵体）。T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
（3）温度：一般37℃诱导3-4小时，30℃诱导6小时是蛋白表达的最大产量期。22℃、18℃、16℃等低温诱导时间在12h-48h。低温诱导可使蛋白缓慢合成，利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白。为了得到更多的可溶性蛋白，可以考虑将温度再降（但表达总量会有所降低），可以考虑25°，诱导8-10个小时；20°诱导14-18个小时；甚至15°24-36小时诱导。
二、
检测诱导表达
1.细菌的裂解裂
常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。
下面介绍酶溶法和超声破碎法结合使用的实验步骤。
（1）常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。4
℃，5000rpm 离心，15
min ，收集诱导表达的细菌培养液（30 mL ）。弃上清，1mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀，30℃作用1h。
（2）超声破碎细菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm
,4 ℃离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，待检测。
注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3
-4 次冻溶后更容易破碎。
2．进行SDS –PAGE检测
（1）表达结果：
a细胞质中表达；b包涵体形式表达。
（2）包涵体的纯化
a包涵体的洗涤；b包涵体的溶解；c包涵体的检测
从基因角度改造一下，如果能够去掉一些疏水区段会很大程度上改善蛋白的可溶性
（4）注意事项
a所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
b根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。具体的序列和说明
c包涵体蛋白溶液保存在四度里，避免反复冻融，否则体系不稳定，蛋白以沉淀析出；胞质蛋白不能在四度放置很久，因为上清中含有很多蛋白酶，会把靶蛋白降解掉。
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