2012-10-08 15:22 星期一

　　打开峰图文件，依据图形初步判定测序质量，SAP酶纯化后的头峰杂度比较大，至少前50bp序列一般不可信，后续峰形如果还不错，主峰高、噪峰低、未见干扰峰，测序结果应该可信。一个正常的成功反应，能保证测序峰形清晰的长度为500 Bases (实际600 —800 Bases)。 在进行DNA测序时，紧接引物的10 — 30 Bases有时不一定能完全读清楚。
　　 由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/C rich; G/C Cluster；Poly A、 Poly T的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下：
　　1： 测序结果有很多套峰，出现很多N值
　　原因分析：
　　PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
　　在序列的起始端出现N值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。
　　模版本身含杂合序列，有等位基因。
　　
　　2：为什么找不到我的PCR引物序列？
　　用PCR引物作为测序引物，所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中，由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。
　　
　　3：测序结果和文献资料不一样，为什么?
　　原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。
　　
　　4：过短的PCR产物为什么不适于直接测序？
　　首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化；再者，测序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不适于直接测序。
　　
　　5：酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰，酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。
　　图一：打开峰图文件，依据图形初步判定测序质量，SAP酶纯化后的头峰杂度比较大，至少前50bp序列一般不可信，后续峰形如果还不错，主峰高、噪峰低、未见干扰峰，测序结果应该可信。一个正常的成功反应，能保证测序峰形清晰的长度为500 Bases (实际600 —800 Bases)。 在进行DNA测序时，紧接引物的10 — 30 Bases有时不一定能完全读清楚。
　　 由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/C rich; G/C Cluster；Poly A、 Poly T的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下：
　　1： 测序结果有很多套峰，出现很多N值
　　原因分析：
　　PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
　　在序列的起始端出现N值，主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰，是机器无法正确判读出位何值。有时，引物二聚体或者起始端小片段的丢失，也会出现N值。
　　模版本身含杂合序列，有等位基因。
　　
　　2：为什么找不到我的PCR引物序列？
　　用PCR引物作为测序引物，所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中，由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。
　　
　　3：测序结果和文献资料不一样，为什么?
　　原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。
　　
　　4：过短的PCR产物为什么不适于直接测序？
　　首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化；再者，测序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不适于直接测序。
　　
　　5：酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰，酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。
　　
　　图一：http://www.seq.cn/data/attachment/forum/201210/07/145430uipp2dd8wnjiph3l.png
　　第一个峰，重叠干扰。如果不判读为干扰峰，那就说明样品不纯，如果是基因组DNA，就很好地说明了样品为杂合子，该位点可能存在SNP现象（T/G）。如果判读为干扰峰，我们只需认定样品此处碱基为T为行了。第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G），如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。
　　
　　6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象?
　　（1） 下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。
　　
　　解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。
　　
　　图二：http://www.seq.cn/data/attachment/forum/201210/07/145459ddnkjbiohjhqjb3j.png
　　2）对于PCR产物也同样有模板不单一的情况，如下图所示，在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。
　　解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。
　　
　　7：poly结构的测序结果
　　图三：http://www.seq.cn/data/attachment/forum/201210/07/1505547q2n2lpfnl2ogrif.png
　　以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。
　　解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。
　　9:G/C rich、G/C Cluster。这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失
　　A T的连续结构。这种情况一般表现为A、T连续结构后 面的测序结果出现套峰。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象)，造成测序结果紊乱，出现套峰。
　　一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验，这一情况的出现和A或T的连续结 构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰，但有时60～70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。
　　一般来说，PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应(测序反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。
　　 原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消 失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。
来自：测序之家 http://blog.tianya.cn/blogger/post_read.asp?BlogID=4512360&PostID=47120944