加载中…DNA 测序常见问题解答（FAQs）
(2010-09-15 19:55:10)
标签：
dna测序 |
分类： 生物实验 |
Q2. 为什么在测序报告上找不到我的引物序列？
Q3. 我有一个大于2KB的PCR片段，希望你们帮我测通。
Q4. 为什么我的PCR片段为300bp，而你们发送给我的序列却达到了700多bp？
Q5. 我的引物做PCR效果很好，为什么用于测序总得不到好的结果？
Q6. 我进行PCR反应时，所用的退火温度是59℃，是否可以用该温度对我的样品完成测序反应？
Q7. 我的PCR扩增产物有多条带，是否可以为我完成切胶纯化，再进行测序反应？哪些情况下需要进行切胶纯化？
Q8. 我的PCR产物为单一条带，但未经纯化，是否可以直接送到贵公司进行测序？
Q9. 我的PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？
Q10. 什么是碱基缺失？
Q11. 什么是引物不纯？
Q12. 重复结构对测序有哪些影响？
Q13. 什么是模板不单一？
Q14. poly结构的测序结果是怎样的？
Q15. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？
Q1. DNA测序的原理是什么？步骤如何？ABI 3730XL型测序仪测序的准确度如何？
答：DNA测序的原理是末端终止法。具体步骤如下：
Q2. 为什么在测序报告上找不到我的引物序列？
答：1）如果您提供的是PCR样品，在测序报告上找不到您的引物序列是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。实际上不但测序引物无法识别，而且由于目前测序技术的局限性，紧靠测序引物一侧的30～50个bp通常也无法100％识别，如果需要验证这个区域的碱基序列或者测序引物本身的序列，就需要用另一侧引物进行反向测序。2 ）您提供的是质粒或菌液样品,使用通用引物测序，找不到您的PCR引物可能是因为您的PCR引物距离载体的通用引物位点过近，由于测序反应在距离起始位点30-50bp内的结果可信度不高，因此会影响您正确读取您的PCR引物序列。
Q3.我有一个大于2KB的PCR片段，希望你们帮我测通。
答：对于片段较大的PCR样品我们建议您将其克隆进载体后再做测序。因为，一方面PCR产物的纯度不是很好掌握，测序的成功率不如质粒和菌液测序；另一方面，与PCR引物相比，一般载体上的通用引物与模板结合的能力更强。
长度为1Kb的DNA模板需要两个测序反应，才有可能得到完整准确的读长，对于1kb以上的DNA片断，在两个反应后还需要设计合成测序引物，测序后拼接出全长，对于这些测序引物，我们将按碱基个数收取引物合成费用。
Q4.为什么我的PCR片段为300bp，而你们发送给我的序列却达到了700多bp？
答：如果您查看峰图的话，可以在您的PCR序列终止处看到一个高高的A峰，该A峰是您的PCR测序反应的结束标志，在此标志之后的序列是噪音，而不是您的测序结果。因为我公司完全忠实于测序结果，不会对测序结果进行人为修改。所以在您收到结果时，请结合我们的《DNA测序服务报告》查看测序峰图，按照您的实验要求对测序结果进行分析。
Q5. 我的引物做PCR效果很好，为什么用于测序总得不到好的结果？
答：用于测序的引物比用作PCR反应的引物要求高，以下是不适合用于测序反应的引物类型：
Q6. 我进行PCR反应时，所用的退火温度是59℃，是否可以用该温度对我的样品完成测序反应？
答：非常抱歉，目前我公司不会单独对客户的测序反应设定特定的条件，全部的测序反应均在统一的条件下完成。
Q7. 我的PCR扩增产物有多条带，是否可以为我完成切胶纯化，再进行测序反应？哪些情况下需要进行切胶纯化。
答：目前我公司通常只接收单一条带的PCR产物，一般不提供切胶纯化服务。如果老师自己实验室的确无法完成切胶工作，在同意交付25元/条带的服务费后，我公司可以提供此项服务。PCR产物电泳检测后发现以下情况之一时，建议进行切胶纯化：1）除主带外，还存在其他条带；2）引物二聚体在过柱纯化后还大量存在，将影响测序结果；3）体系中盐分在过柱纯化后还影响测序结果。
答：可以。我公司将免费为您进行PCR产物的过柱纯化，目的在于去除PCR反应体系中的大部分小片段、剩余dNTP及大部分的盐分。
Q9. 我的PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？
答：PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例：该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。
http://jiyin.uncc.cn/UserFiles/faq-q9.jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。
Q10.什么是碱基缺失？
答：以下图为例：
http://www.sinogenomax.com/UserFiles/faq-10(2).jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
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解决方法：1) 使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序；2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。
Q11.什么是引物不纯？
答：以下图为例：
http://www.sinogenomax.com/UserFiles/faq-q11.jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
引物不纯造成移码现象，该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。
解决方法：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。
Q12.重复结构对测序有哪些影响？
答：以下图为例：
http://jiyin.uncc.cn/UserFiles/faq-12.jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
重复结构将导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。
Q13.什么是模板不单一？
答：以下图为例，下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。
解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。
http://www.sinogenomax.com/UserFiles/faq-13-1.jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
对于PCR产物也同样有模板不单一的情况，如下图所示：
http://jiyin.uncc.cn/UserFiles/faq-13-2(1).jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。
解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。
Q14.
poly结构的测序结果是怎样的？
答：以下图为例：
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http://www.sinogenomax.com/UserFiles/faq-14.jpg测序常见问题解答（FAQs）" />
以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。
Q15.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？
答：以下图为例：
http://www.sinogenomax.com/UserFiles/image001(1).png测序常见问题解答（FAQs）" />
位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。
解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。
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