实验讲义

溶菌酶的提取和活性测定

溶菌酶的提取和部分纯化

【试验目的】

   掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。

【试验原理】

溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。

溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。

蛋白	含量	等电点（pI）	分子量（Da）
白蛋白	54	4.5	46,000
转铁球蛋白	12	6.05	76,600
粘蛋白	11	4.1	28,000
溶菌酶	3.4	10.7	14,300
蛋清抑制因子	1.5	5.1	49,000
巨球蛋白	0.5	4.5	900,000
糖蛋白	1.0	3.9	24,400
卵白素	0.0510	10	68,300

从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。

【仪器、材料和试剂】

(一)、仪器

分光光度计

（二）、材料

1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）

2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）

3、新鲜鸡蛋

4、Amberlite阳离子交换树脂

5、氯化钠

（三）试剂

1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。

2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0）， 浓度0.05M。

3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0）， 浓度0.5M。

【实验步骤】

（一） 树脂的再生

Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。在PBS缓冲液平衡12小时以上。

（二）蛋清样品的准备  

市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。

（三）阳离子交换柱层析  

1、吸附  

在已平衡好的20ml阳离子交换树脂中加入30ml蛋清样品，搅拌吸附1h。搅拌应缓慢。

2、 洗涤  

静置，使树脂完全沉淀，去除上清液，树脂用100mlPBS缓冲液（pH7.0）缓慢搅拌洗涤，每次5min，重复三次，以去除未吸附的杂蛋白。

3、 装柱及洗脱杂蛋白  

将树脂搅拌均匀，装入层析柱内（装柱前，应保证所有接头密闭、管道通畅。装柱时，流速不得超过3ml/min。自此以后各步骤全过程绝对不能出现“流干”现象。）。用含0.05mol/L NaCl 的PBS缓冲液洗涤（pH7.0），以去除与阳离子交换树脂结合不紧密的杂蛋白。同时以0.1mol/L的磷酸缓冲液为对照，用分光光度计于280nm处测流出液体的吸光度。洗至吸光系数接近0为止（约洗3-5个柱体积）。流速控制为2-3 mL/min。

4、 洗脱溶菌酶  

用含0.5mol/L NaCl 的PBS缓冲液（pH7.0），以2-3 mL/min的流速洗脱溶菌酶（约洗5个柱床体积），并分部收集，每管收集2-3ml。收集完成后，以0.5mol/L NaCl 的PBS缓冲液（pH7.0）为对照，用分光光度计测每管收集液在280nm处的吸光度。合并光吸收高峰管，量取体积，置于-20°C冻存备用（标记为样品2）。

 

 

II 蛋白浓度和酶活性的检测

【实验目的】

    掌握蛋白质浓度的测定方法和溶菌酶活性的测定方法。掌握蛋白质比活性、纯化倍数和回收率的计算。

【实验原理】

考马斯亮兰G250有红、兰两种不同的颜色形式，在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当和蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅和蛋白质浓度高低成正比。

溶壁微球菌是一种革兰氏阳性细菌，对溶菌酶特别敏感。一定浓度的细菌悬液在450nm处对光有一定的吸收值。由于溶菌酶的水解作用，使细菌裂解，浓度降低，细菌悬液的光吸收值减少，据此可以推测溶菌酶的活性。

就像用重量或者摩尔浓度衡量物质的多少一样，通常用酶的活性单位（U）来衡量酶的数量的多少，尤其是衡量不纯的酶的数量。由于不同的酶催化不同的底物发生反应，因此，对于不同的酶，在不同的活性测试系统中，其活性的表示方法不同。常用的酶的活性单位表示在一定时间内催化底物生成产物的多少。对于溶菌酶来说，由于无法直接检测出底物或产物的数量，因此，把它的活性定义为，在特定的实验条件下，每分钟使底物溶液的OD值下降0.001为一个活性单位。

酶的比活力（specific activity）是指每毫克蛋白中所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。比活力是酶制剂的一个纯度指标，随着酶制剂的逐步纯化，其比活力将逐渐提高。

【仪器、材料和试剂】

(一)、仪器

分光光度计

（二）、材料

1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）

2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）

3、溶壁微球菌（M. lysodeikticus）干粉

4、考马斯亮兰G250

5、牛血清白蛋白

6、88％磷酸

7、95％乙醇

8、蛋清

9、提取纯化的溶菌酶

（三）试剂

1、BSA标准溶液：BSA溶于含0.1mol/L NaCl的0.1M PBS，配置成1mg/mL。

2、考马斯亮兰G－250试剂：100mg考马斯亮兰G－250溶于50ml 95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，混匀，配成原液。使用时，每15mL原液加蒸馏水稀释到100mL，滤纸过滤。

3、测活缓冲液：0.1M的磷酸盐缓冲液，pH6.25。

4、底物溶液：溶壁微球菌溶于测活缓冲液（6mg/ml），用细胞匀浆器研磨1－2分钟，使菌体充分散开，4可保存一周。用时，用测活缓冲液（室温）配成0.2mg/ml工作液，充分混匀，1小时内用完。

【实验步骤】

（一）蛋白浓度的测定

1、制定标准曲线

取14只试管，按下表分两组进行平行操作

管号	0	1	2	3	4	5	6
考马斯亮兰试剂(mL)	2.9
PBS（mL）	0.1	0.09	0.08	0.07	0.06	0.05	0.04
标准BSA蛋白（mL）	0	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06
摇匀。在反应2min－1h内，以0号试管为空白对照，在595nm处比色。 记取吸光度值。

以OD595值为纵坐标，标准蛋白量为横坐标，绘制标准曲线。

2、测定蛋清和提取物的蛋白浓度

    方法同上。取合适样品体积，使其测定范围在标准曲线的直线范围内。根据所测得的OD595值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，从而确定样品的蛋白浓度。

（二）、蛋清和提取物的活性测量

1、 配置0.2mg/mL的底物溶液。

2、 取一个比色皿，加入3ml底物缓冲液，在450nm处调零。（注意：不是用底

物溶液调零）

3、 将步骤一所配底物溶液摇匀，取2.9ml底物溶液加入另一只比色皿，等到其吸光度值不再变化时，记取此时的吸光度值为0秒的OD值。

4、 取0.1 ml的测试溶液（蛋清活提取物），迅速加入比色皿中，并吹打5－10秒。在加入测试溶液的同时同步地按下秒表或看手表计时，分别在15s、30s、45s、60s测量吸光度（OD）值。记录读取的吸光度值。

5、 判断所用的溶菌酶浓度是否在合适的测量范围。判断的标准是，每分钟下降

的OD值应该在0.03－0.1之间，并且尽可能使各个时间点OD值分布在一条直线上。如果溶菌酶浓度不在合适的测量范围，则稀释后重新测量活性，直至找到该范围。记录此时的稀释倍数和各时间点OD值。

（三） 、计算蛋清和提取物的溶菌酶活力、比活力，计算提取物中溶菌酶的纯化倍数

    溶菌酶的活力单位（U）定义为：在室温，OD450值每分钟降低0.001为一个活力单位U。

溶菌酶的活力（U/ml）＝（0秒的OD值－60s的OD值）×1000×稀释倍数

    溶菌酶的比活(U/mg)＝测试物溶菌酶活力（U/mL）÷测试物蛋白浓度（mg/ml） 

    纯化倍数＝提取物溶菌酶比活力÷蛋清溶菌酶比活力