分光光度法测定溶菌酶活力

分光光度法测定溶菌酶活力

目的要求：

1.掌握溶菌酶的活力测定的原理和方法；

2.掌握分光光度计的使用。

实验原理

溶菌酶又叫胞壁质酶，N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。能催化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁，起到杀死细菌的作用。测定溶菌酶活力时，可用某些细菌细胞壁做底物，细胞壁溶解，细菌解体后，菌悬液浊度降低，因此，可以通过分光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。本次试验我们直接用BIOSHARP生物公司生产的溶菌酶成品。因为溶菌酶对革兰氏阳性菌的细胞壁的溶解作用更加明显，所以本次试验以枯草杆菌做为细菌底物。溶菌酶活性75~250u/mL之间，底物悬液吸光度值0.45~0.77（OD450）之间，酶活力曲线具有良好的线性关系，与国家药典中基本一致。所以实验应控制底物悬液吸光度在最适范围，以及设定分光光度计450nm波长。

试剂器材

1.试剂   1mol/L氢氧化钠溶液；1mol/L盐酸溶液；0.1mol/L磷酸缓冲液（PH=6.2）：NaHPO·2HO  11.7 g、NaHPO· 12HO  7.86g及EDTA(乙二胺四乙酸二钠)  0.392g，溶于蒸馏水并稀释至1000mL，调节pH至6.2。

牛肉膏培养基：牛肉膏 3g、蛋白胨 5g、Nacl  5g及水1000mL。

溶菌酶结晶标准品（从生物公司购得）酶活力单位为70000U/mg。

2.器材   试管及试管架；恒温水浴锅；匀浆器；离心机；三角瓶；分光光度计；高压蒸汽灭菌锅；超净工作台等。

操作步骤

1.枯草杆菌培养

1.1按配方分别称取培养基各组分，.按顺序依次加入各组分于水中进行加热溶解。注意水温不要过高，防止组分结块沉淀，并要不断搅拌。

1.2用滴管逐滴加入1mol/L氢氧化钠溶或盐酸溶液，边加边搅拌。用精密PH试纸测定其pH知道符合要求pH7.2-7.4  （也可用PH计测定）

1.3按要求倒入三角瓶中。塞紧棉塞。用报纸包好。然后将培养基于高温高压灭菌锅中灭菌。调节温度121，时间20min。

1.4将灭菌后的培养基保温培养2-3天，检查灭菌效果，无菌生长方可使用。

1.5将灭菌并未被污染的培养基接种提前准备好的枯草杆菌菌种，置于37摇床振荡培养。2-3天后可观察到细菌生长。

2.底物制备与酶活力的测定

2.1底物的制备

2.1.1.将菌液4000r/min离心20min，收集菌体沉淀5mg。

2.1.2.用少量磷酸缓冲液溶解，于匀浆器中研磨数分钟。收集匀浆液稀释到20-25ml。此为底物溶液。比色测定A450应在0.5-0.7范围内。

2.2.酶活力测定

2.2.1酶液的制备：准确称量溶菌酶结晶5mg，用0.1mol/L磷酸缓冲液5ml溶解成1mg/ml的酶液。临用时，用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释4倍，即为酶应用液。

2.2.2.将酶液和底物溶液分别置于25水浴中保温10~15min。然后加入3.0ml底物溶液到比色皿中，测定底物溶液的吸光度为。然后加入酶应用液0.2ml。迅速摇匀，同时开始计时，每隔30秒测定一次，共测三次（90秒）。

结果与讨论

酶活力单位定义为：每分钟A450下降0.001所需酶量为一个活力单位（25`C，PH6.2）

        L=1000×（－）×5×稀释倍数／0.2×m

式中，L为每毫克酶的活力单位；为零时450nm处的吸光度；为1min时450nm处的吸光度；m为称取的溶菌酶结晶的质量（mg）；1000为0.001的倒数；5为酶液体积（mL）；0.2为测定时所取的酶液的体积（mL）。

测得底物溶液吸光度为=0.572；30秒时吸光度为0.547；60秒时吸光度为0.544；90秒时0.541；

将上述结果代入公式计算结果：  L=1000×（0.572－0.544）×5×4／0.2×5

             =14000u/mg

标准酶的活力单位为70000u/mg，本实验所得结果为14000u/mg。分析原因可能有以下几点：

1. 由于实验中所用到的酶成品是从BIOSHARP生物公司购得。运输过程中由于温度不适等问题导致酶活力下降。

2. 溶菌酶需在－20环境保存。可能由于保存温度问题使酶活力下降。

注意事项

1. 培养基制作的过程要注意控制温度不要太高，防止成分结块沉淀。

2. 应注意控制活力测定时，底物溶液的浓度不要太高，防止细菌菌体沉淀造成吸光度降低影响实验。