淋巴细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞。从淋巴细胞中选择性分离出均质的特殊淋巴细胞群及亚群，对深入研究免疫细胞的分化过程、生物学特性与功能等具有重要意义。目前采用的分离方法有E花环形成分离法、尼龙毛柱分离法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪分离法等。本试验以E花环形成试验为例。
    实验原理：人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，能够与SRBC结合形成花环样细胞团(即E花环)。此试验用于计数T细胞数量，可判断机体细胞免疫状况。由于T细胞的异质性，其对SRBC的亲和力亦不同，因而T细胞可形成不同类型的E花环，其中在4℃放置1 h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et花环)，而淋巴细胞与SRBC混合后不经4℃作用立即反应形成的花环称为活性花环(Ea花环)。
    主要试剂和器材：
    1. 肝素抗凝剂  用Hank,s液将肝素配成500U/ml，分装，每管0.1ml，置4℃备用。
    2.淋巴细胞分离液(密度为1.077±0.001)。
    3.小牛血清  56℃加热灭活30 min，按2∶1比例与沉积SRBC混合，置37℃30 min后，2000r/min离心20min，收集上清液备用。
    4.0.5%SRBC悬液  无菌取绵羊血，脱纤维，或Alsever液保存的绵羊血，用5～10倍量生理盐水洗3次。第3次2500r/min离心10min，弃上清液，用生理盐水配成0.5%SRBC悬液(约108个细胞／ml)。
    5.0.8%戊二醛  取4.5g/L NaCl盐水30.25 m1，加入25%戊二醛lml。
    6.姬姆萨-瑞氏染液  取磷酸缓冲液10ml，加入姬姆萨染液6滴及瑞氏染液1滴。
    7.Alsever液、Hank,s液(无Ca2+和Mg2+，pH7.2～7.4)、1/15mol／L PB(pH 7.0～7.4)、生理盐水。
    8.离心机、水浴箱、电冰箱、显徽镜、离心管、载玻片、盖玻片、吸管、吸球、注射器。
    操作方法：
    1.淋巴细胞悬液的制备：取2ml肝素抗凝血，加入Hank,s液2ml，叠加于2ml淋巴细胞分离液上，2000r/min水平离心20min。取出单个核细胞层，用4倍Hank,s液洗2次，每次1000r/min离心10min。弃去上清液，留下沉淀细胞约0.2ml。
    2.Et花环试验：
    ⑴取0.5%SRBC悬液0.2ml和小牛血清0.1ml加入到上述的淋巴细胞沉淀管中混匀，置37℃水浴5min。
    ⑵取出500r/min 离心5min，置4℃1～2h或过夜。
    (3)沿管壁加入0.8%戊二醛0.2ml，置4℃20min。
    ⑷弃上清，留约0.2m1，轻轻吹吸混匀沉淀细胞。
    ⑸结果观察：①湿片法：取1滴细胞悬液滴加于载玻片上，加入少许姬姆萨-瑞氏染液染色，加盖玻片后，高倍镜下观察。②干片法：取细胞悬液涂片，自然干燥，用姬姆萨-瑞氏染液染l0min，水洗，干燥后，高倍镜或油镜下观察。
    3.Ea花环试验：与Et花环试验基本相同，不同之处是SRBC悬液的浓度为0.1%，SRBC与淋巴细胞混合之比为10∶1～20∶1，混合后立即1000r/min离心5min。加入戊二醛固定，染色，结果观察均与Et花环试验相同。
    结果判断：淋巴细胞呈蓝紫色或淡蓝色，SRBC不着色，凡结合3个SRBC或以上者为E花环形成细胞(ERFC)。计数200个淋巴细胞，求出E花环形成率(%)。
    正常值：EtRFC为60%～80%，EaRFC为20%～40%。
    注童事项：
    1.SRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，在Et花环试验中，置4℃应至少1h以上或过夜。
    2.绵羊红细胞以保存1周内最好，超过2周则与淋巴细胞结合力下降，超过5～6周则不能再用。
    3.Et花环试验SRBC与淋巴细胞混合比例以100∶1～200∶1为宜，Ea花环试验中以10∶1～20∶1为宜；淋巴细胞离体后不能超过6h，否则会影响花环形成率。
    4.温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应保持一致，从4℃取出后应立即计数。
    5.计数前将沉淀细胞重悬时，使细胞团块松散均匀即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。
    应用与评价：该试验可用于先天性细胞免疫缺陷病的检测；肿瘤病人疗效观察及预后判断；评价迟发型超敏反应、某些感染和组织器官移植，了解机体细胞免疫状态；探讨某些疾病发病机理；考核药物疗效及研究药物作用机理；也可用于T淋巴细胞的分离。
    该方法简便易行，曾被广泛应用，但影响因素较多，结果偏差较大，已被CD抗原免疫检测法取代。