水中细菌学检查

 

I  水中细菌总数的测定

一、目的要求

l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2．了解水源水的平板菌落计数的原则。

二、基本原理

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。

三、器材

l．培养基   肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。

2.仪器或其他用具   灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

四、操作步骤

l．水样的采取

(1)自来水   先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

(2)池水、河水或湖水   应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。

2．细菌总数测定

(1)自来水

①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。

②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。

③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。

④培养基凝固后，倒置于37℃ 温箱中，培养24h，进行菌落计数。

⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。

(2)池水、河水或湖水等

①稀释水样   取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10^-1、10^-2与10^-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。

一般中等污秽水样，取10^-1、10^-2、10^-3三个连续稀释度，污秽严重的取10^-2、10^-3 、10^-4三个连续稀释度。

②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。

3．菌落计数方法

(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

(2)首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数(见表26-1，例1)。

(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数(见表26-l，例2及例3)。

(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表26-l，例4)。

(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数(见表26-l，例5)。

(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数(见表26-1，例6)。

 

 

表26—1  计算菌数落总数方法举例

例次	不同稀释的平均菌落数			两个稀释度菌落数之比	菌落总烽（个/ml）	备注
	10-1	10-2	10-3
1	1365	164	20	--	16400或1.6×104	两位以后的数字采取四舍五入的方法去掉
2	2760	295	46	1.6	37750或3.8×104
3	2890	271	60	2.2	27100或2.7×104
4	无法计数	1650	513	--	513000或5.1×105
5	27	11	5	--	270或2.7×104
6	无法计数	305	12	--	30500或3.1×104

五、实验报告

1．结果

（1）自来水

平板	菌落数	1ml自来水中细菌总数
1
2

 （2）池水、河水或湖水等

稀释度	10-1		10-2		10-3
平板	1	2	1	2	1	2
菌落数
平均菌落数
计算方法
细菌总数/mL

 

 2．思考题

（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？

（2）你所测的水源水的污秽程度如何？

（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度，培养时间等）来测定水样总数呢？为什么？

 

II  水中大肠菌群的检测

一、实验目的和内容

目的：学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。

内容：1．用滤膜法检测大肠菌群。

2．用多管发酵法检测大肠菌群。

二、实验材料和用具

复红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基)、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨培养液、三倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基(EMB 培养基)。

微孔滤膜(孔径0.45µm)、滤器(容量500mL)、抽气设备、镊子、发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻度吸管或移液管、接种环、酒精灯。

三、操作步骤

(一)水样的采集

1．自来水   将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙头流水5min， 以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。

2．池水、河水或湖水   将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。

(二)滤膜法检测大肠菌群

l．用无菌镊子将一无菌滤膜置于滤器的承受器当中，将过滤杯装于滤膜承受器上，旋紧，使接口处能密封，将真空泵与滤器下部的抽气口连接(图26-1)。

2．加水样100mL于滤杯中，启动抽真空系统，使水通过滤膜流到下部，水中的菌细胞被截留在滤膜上。水样用量可适当增减使获得菌落适量。

3．用无菌镊子小心将截留有细菌的滤膜取出，平移贴于复红亚硫酸钠固体培养基上(注意无菌操作，滤膜与培养基间贴紧，无气泡)，37℃培养16～l8h。挑选深红色或紫红色、带有或不带金属光泽的菌落，或淡红色、中心色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。

4．经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，再接种在乳糖蛋白胨半固体培养基上，37℃培养6～8h后观察，产气者证实为大肠菌群阳性。培养中应及时观察，时间过长则气泡可能消失。

5．结果计算

水样中总大肠菌群数/个·L^-1=（滤膜生长的菌落数/过滤水样量/mL）×100

（滤膜上菌落数以20～60个/片较为适宜）

(三)多管发酵法检测大肠菌群

1．取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样lmL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入按1：10稀释的水样lmL（即相当于原水样0.1mL），均贴好标签。此即为15管法，接种待测水样量共计55.5mL。各管摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

若待测水样污染严重，可按上述3种梯度将水样稀释10倍(即分别接种原水样1mL、0.lmL、0.01mL)、甚至100倍(即分别接种原水样0.lmL、0.01mL、0.001mL)，以提高检测的准确度。此时，不必用3倍浓乳糖蛋白胨培养基，全用乳糖蛋白胨培养基。

2．取出培养后的发酵管，观察管内发酵液颜色变为黄色者记录为产酸，杜氏小管内有气泡者记录为产气。将产酸产气和只产酸的两类发酵管分别划线接种于伊红美蓝培养基上，在37℃恒温箱中培养18～24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有或不带有金属光泽的菌落、或淡紫红色和中心色较深的菌落，将其一部分分别取样进行涂片和革兰氏染色观察。

3．经镜检证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则将此菌落的另一部分接种于装有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培养液的复发酵管中，每管可接种同一发酵管的典型菌落1～3个，37℃培养24h若为产酸产气者表明试管内有大肠菌群菌存在，记录为阳性管。

4．根据3个梯度(10mL、1ml、0.1mL)每5支管中出现的阳性管教(即为数量指标)，查附注的“15管发酵法水中大肠菌群5次重复测数统计表”（表26-2）的细菌最可能数，再乘以100即换算成1升水样中的总大肠菌群数。

四、注意事项

认真配制不同类型培养基。

检测中应合理控制所加的水样量。

在滤膜法中每片滤膜的菌落数以20～60个为宜。多管发酵法中水样稀释比例要适宜。

挑选菌落时认真选择大肠菌群典型菌落。

五、演示

1．具有大肠菌群的发酵管中产酸与产气特征的观察。

2．在复红亚硫酸钠培养基和伊红美蓝培养基上大肠菌群典型菌落的色泽及特征的识别。

六、实验报告

(一)实验结果记录

1．微孔滤膜法

过滤水样量（mL）：            ，37℃培养后特征菌落数：       ，接种乳糖培养基后的阳性管数：             。

总大肠菌群数（个/L）：        。

2．多管发酵法检测结果

（1）根据实验数据查表26—2：

表26—2  15管发酵法水中大肠菌群5次重复测数统计表

数量指标*	细菌最可能数	数量指标	细菌 最可能数	数量指标	细菌最可能数	数量指数	细菌最可能数
000	0.0	203	1.2	400	1.3	513	8.5
001	0.2	210	0.7	401	1.7	520	5.0
002	0.4	211	0.9	402	2.0	521	7.0
010	0.2	212	1.2	403	2.5	522	9.5
011	0.4	220	0.9	410	1.7	523	12.0
012	0.6	221	1.2	411	2.0	524	15.0
020	0.4	222	1.4	412	2.5	525	17.5
021	0.6	230	1.2	420	2.0	530	8.0
030	0.6	231	1.4	421	2.5	531	11.0
100	0.2	240	1.5	422	3.0	532	14.0
101	0.4	300	0.8	430	2.5	533	17.5
102	0.6	301	1.1	431	3.0	534	20.0
103	0.8	302	1.4	432	40	535	25.0
110	0.1	310	1.1	440	3.5	540	13.0
111	0.3	311	1.1	441	4.9	541	17.0
112	0.5	312	1.7	450	4.0	542	25.0
120	0.3	313	2.0	451	5.0	543	30.3
121	0.5	320	1.4	500	2.5	544	35.0
122	1.0	321	1.7	501	3.0	545	45.0
130	0.5	322	2.0	502	4.0	550	25.0
131	1.0	330	1.7	503	6.0	551	35.0
140	1.1	331	2.0	504	7.5	552	60.0
200	0.2	340	2.0	510	3.5	553	90.0
201	0.7	341	2.5	511	4.5	554	160.0
202	0.9	350	2.5	512	6.0	555	180.0

*数量指标示意：如“203”，表示5个10mL初发酵管中有阳性管2个；5个1mL初发酵管中有阳性管0个；5个0.1mL初发酵管中有阳性管3个；又如“555”，则表示15个初发酵管均为阳性管。 

 （2）多管发酵法结果填于下表中：

初发酵管
初发酵管数	每管取样数/mL	产酸产气管数	复发酵管数	阳性管数
5	10
5	1
5	0.1

（3）多管发酵法检测结果：查表结果及总大肠菌群数（个/L）

（二）试图解说明检测水样中大肠菌群的操作过程。

七、问题和思考

1．检查饮用水的中大肠菌群有何意义？比较本实验中两种检测方法的优缺点。

2．试设计一个监测某自来水厂水质卫生状况的方案。

 

多管发酵法测定水中大肠菌群

　　一、目的要求

　　1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。

　　2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。

　　二、基本原理

　　多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

　　1．初（步）发酵试验

　　发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

　　水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。

　　2．平板分离

　　平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。

　　3．复发酵试验

　　以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

　　三、器材

　　乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；

　　载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。

　　四、操作步骤

　　1．水样的采取

　　同实验五十九。

　　2．自来水检查

　　（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。

　　（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养 18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

　　（a）深紫黑色、有金属光泽。

　　（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。

　　（c）淡紫红色、中心颜色较深。

　　（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。

　　证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。　　3．池水、河水或湖水等的检查

　　（1）将水样稀释成10^-1与10^-2。

　　（2）分别吸取1ml10^-2、10^-1的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有 5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。

　　（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。

　　（4）将100、10、1、0．1（10^-1）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0．1（10^-1）、0．01（10^-2）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数。　

　　五、实验报告

　　1．结果

　　（1）自来水

　　100ml水样的阳性管数是多少？

　　10ml水样的阳性管数是多少？

　　查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？

　　（2）池水、河水或湖水

　　 阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。

　　 查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？

　　 查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？

　　2．思考题

　　（1）大肠菌群的定义是什么？

　　（2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？

　　（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？

　　（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？