酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

一、   目的要求

1.         进一步学习并掌握光学显微镜低倍镜和高倍镜的使用方法；

2.         观察并掌握酵母菌的个体形态及其子囊、子囊孢子和假菌丝的形态；

3.         学习并掌握鉴别酵母菌细胞死活的方法；

4.         了解酵母菌子囊孢子的染色方法及假菌丝观察的压片培养法。

二、   实验材料

1.         菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Sachizosaccharomyces pombe）

2.         染色液：0.1％美蓝染色液、孔雀绿染色液、沙黄染色液、95％乙醇等

3.         其他：显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸等

三、   基本原理

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍，因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂殖；子囊菌纲中的酵母菌在一定条件下，可产生子囊孢子的方式进行有性生殖。酵母菌假菌丝的生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。

美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能将美蓝由兰色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。

四、   操作步骤

1。水浸片观察：

1）制片：在干净的载玻片中央加一滴预先稀释至适宜浓度的酵母液体培养物，从侧面盖上一片盖玻片（先将盖玻片一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上），应避免产生气泡，并用吸水纸吸去多余的水分（菌液不宜过多或过少，否则，在盖盖玻片时，菌液会溢出或出现气泡而影响观察；盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡）。

2）镜检：将制作好的水浸片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，注意观察各种酵母的细胞形态和繁殖方式，并进行记录。

2。美蓝染色

1）染色：在干净的载玻片中央加一小滴0.1%美蓝染色液，然后再加一小滴预先稀释至适宜浓度的酿酒酵母液体培养物，混匀后从侧面盖上盖玻片，并吸去多余的水分和染色液（注意染色液和菌液不宜过多或过少，并应基本等量，而且要混匀）。

2）镜检：将制好的染色片置于显微镜的载物台上，放置约3min后进行镜检，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，根据细胞颜色区分死细胞（蓝色）和活细胞（无色），并进行记录。

3）比较：染色约30min后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。

酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 

死亡率=死细胞总数÷死活细胞总数×100%

3．酵母菌液泡系的话体观察  

于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。

4.酵母菌细胞中肝糖粒的观察  

将1滴碘液置于载玻片中央，接人上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。

5．子囊孢子的染色与观察

1）活化酵母：将酿酒酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，培养24h，然后再转种2~3次

2）生孢培养：将经活化的菌种转移到醋酸钠培养基上，28℃培养7~10d。

3）制片：在洁净载玻片的中央滴一小滴蒸馏水，用接种环于无菌条件下挑取少许产孢培养物至水滴上，涂布均匀，自然风干后在酒精灯火焰上热固定（水和菌均不要太多，涂布时应尽量涂开，否则将造成干燥时间长；热固定温度不宜太高，以免使菌体变形）。

4）染色：滴加数滴孔雀绿染色液，1min后水洗；加95%乙醇脱色30s，水洗；再用沙黄染色液复染30s，水洗，最后用吸水纸吸干。

5）镜检：将染色片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，子囊孢子呈绿色，菌体和子囊呈粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状，并进行记录。

子囊形成率（%）=3个视野中形成子囊的总数÷3个视野中（形成子囊的总数+不产孢子细胞总数）×100%

6.假菌丝的观察

压片培养法：取新鲜的酵母菌在薄层马铃薯浸出汁琼脂培养基平板上划线接种2~3条，取无菌盖玻片盖在接种线上，于25~28℃培养4~5天后，打开皿盖，置于显微镜下直接观察划线的两侧所形成的假菌丝的形状。

另一法：取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在温室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图12—1)，28℃培养2～3d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图12—2)。

自然状态下的酵母菌观察   取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。

7.自然状态下的酵母菌观察   

取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。

注：酵母菌的简易培养  

配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度2～2cm)，加HCl调至pH3～5放入几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮），置5～28℃温箱中培养2～3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检。