土壤中芽孢杆菌的分离
一、实验目的和内容
目的：掌握用平板稀释法分离得到微生物纯种的方法
内容：分离产淀粉酶的芽孢杆菌
二、实验原理
    在自然界中，各种微生物几乎都是杂居在一起的。为了从混杂的样品中取得所需的纯种，或把受杂菌污染的菌种重新分离出来，都离不开分离纯化方法。所以，分离纯化是微生物学实验中最基本的技术之一。
    纯化分离方法很多，归纳起来可分为两大类：一是单细胞（或单孢子）；另一是单菌落分离。后者因方法简便，且不需要特殊仪器设备，所以是一类常用的方法。
    通过形成单菌落获得纯种的方法很多，对于好氧菌及兼性厌氧菌可采用平板划线法、平板表面涂片法或浇注平板法等，其中最简便的是平板划线分离法。平板划线是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板上作多次划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，以培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才能得到纯种。稀释平板法又可分为浇注平板法和平板表面涂布法两种。浇注平板法是将待分离的样品用合适的稀释液作一系列稀释后，从适当的稀释液中，取一定量的菌液加至无菌培养皿中，立即倒入融化验的固体培养基，迅速摇动，使培养基与菌液充分混匀，置合适的温度下培养一段时间，在平板培养基的表面和内层就会出现若干分散的单菌落，然后把典型的单菌落分别挑到斜面上就成为纯种。平板表面涂布法是指取一定量的稀释菌液，于适合该菌生长的平板培养基表面上，然后用无菌的涂布玻棒，把菌液的均匀地涂布在整个平板上，经培养后，在平板培养基表面便形成了若干分散的单菌落，然后分别挑取典型的单菌落于斜面培养基上，经培养后即成为纯化菌种。若长出的菌落不典型或还混有杂菌，则可如法重复分离几次即可达到纯化的目的。

三、实验材料和用具
试剂：牛肉膏蛋白胨淀粉培养基、无菌水、
器材：无菌培养皿、无菌试管、无菌吸管、恒温箱等
四、操作步骤
（一）分离淀粉酶的芽孢杆菌——平板稀释分离法
1 采集土样 厨房蔬菜地土壤于40-60℃烘干研细
2 准备无菌培养皿6套（10^-2、10^-3、10^-4两个重复），贴标鉴
3 熔化培养基（牛肉膏蛋白胨、淀粉培养基冷却至50℃待用）
4 分装无菌水三管，每管4.5ml，并采用逐级稀释法稀释土样
5 取样 取0.5 ml土样稀释液放入相应编号的培养基内放。
6 倒培养基、摇匀平放待凝。
7 于37℃倒置培养24`48小时。
8 检查：在每个皿中加卢戈氏碘液观察，如有菌落周围有无色圈者，即为产淀粉酶的芽孢杆菌
9 挑单菌落接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养
10.划线分离得到纯种
（二）平板划线分离纯化法
1 熔化培养基冷至50，倒平板冷凝。然后倒扣于温箱中，烘30分钟，除去平板表面水分。
2 取分离出的斜面菌或污染的菌种或待分离的菌悬液，进行平板划线分离。
3 划线方法 五、注意事项
1．样品稀释后可先煮沸5分钟，杀死无芽孢菌和芽孢菌的营养体
2．为了取得好结果，应先在纸上练习划线动作，再用空白培养皿作模拟操作，待掌握划线要领后再正式划线，以提高成功率。
3．划线用的接种环，环柄宜稍长，环口宜圆滑，划线时环与平板间的交角宜小，动作要轻巧，以防划破平板。
4．平板不能不能浇得太薄，有条件的情况下，平板应在使用前一天倒成，而且培养基不宜太烫，以防平板表面冷凝水太多，影响分离效果。