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电泳室安全吗?核酸染料是个什么鬼?

(2017-05-09 17:53:05)
分类: 生物学科

大多数的分子实验室都有一个“禁地”——电泳室,很多人认为那里极其不安全,因为那里通常有一种实验必备的东西叫核酸染料。假如有人说某某核酸染料是安全无毒的,那么就会有一大波人跳出来反驳说:“核酸染料怎么会没有毒,没有毒它怎么可能染核酸。我们说一个东西有毒,应该是对人或者动物病理性变化或者致死的东西,而不是可以让DNARNA一闪一闪亮晶晶的东西。 

举一个最简单的例子:EB许多人认为EB是强诱变剂,具有高致癌性,因为EB可以嵌入碱基分子中,导致错配。没错,EB的染色原理是它有可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。但是,我们说了,有毒应该是针对的是人体,不是核酸,有毒的前提至少是EB可以穿透细胞膜进入到细胞内才会与人体内的核酸结合,更何况,我们有皮肤作为保护,最外面还有一层死皮呢。EB是个小分子(分子量394,有空隙就能钻进去,通过细胞膜不成问题,至于能不能通过皮肤,对不起,我没试过。所以,我们不能说EB绝对安全。

溴化乙锭(EB)由于其价格便宜、使用方便已成为最常用的核酸染料,被广泛应用于观察、检测琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中的DNA或RNA。然而EB是一种强诱变剂,具有中等毒性,对皮肤、眼睛、口腔和上呼吸道系统有刺激性作用,对人体有潜在危害性。且废弃的EB染液易污染环境。EB本身在紫外下不发光,与单链、双链或三链DNA结合后发出明亮的荧光,EB-DNA结合物会导致染料的光漂白和DNA单链断裂,且具有潜在的诱变作用。EB的使用方法简单,可在制胶时将其加入进行前染,也可在电泳结束后进行后染。前染有利于节约时间,但是易出现条带变形拖尾等问题,后染较费时,但效果较好。

有很多人说花菁类染料与DNA结合的方式和EB是不同的,不会致癌,而且分子比EB大,不能进入细胞。请问大个几十算大吗,而且谁说花菁类染料不能进入细胞的。还有什么吖啶类染料,分子量都是几百,都属于小分子,大同小异,没什么好探讨的。那到底什么才是真正安全的。没有真的和绝对的安全只有相对的安全。GeneFinderTM、GoldViewTM、SybrGreenI、GelRed和GelGreen。

 

GeneFinderTM是新型的核酸染料,可以代替EB作为各种核酸电泳的染色剂。与强致癌性的EB不同,GeneFinderTM属于花青类染料,毒性较低,GeneFinderTM与dsDNA结合发出荧光,其检测核酸的灵敏度比EB染色法高。GeneFinderTM染料最大吸收峰为470nm,与该染料结合的核酸在紫外线下呈现绿色荧光,另外,该染料同样能引起有机体突变,在使用时候一样要采取适当的保护措施。

GoldViewTM也是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料,采用琼脂糖电泳检测DNA时,GoldViewTM与核酸结合后能产生很强的荧光信号,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。GoldView对于大片段DNA的染色效果较好,但对于500 bp以下的片段效果并不理想,而且它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭,一般约5-10min条带就会消失。所以应尽快拍照、观察。另外,GoldView灵敏度差,本底色严重,不适用于切胶回收。且其毒性较大,尤其在紫外灯下,其诱导突变能力极高。

SybrGreenI也是一种常用的核酸染料,它与双链DNA(dsDNA)结合后,荧光大大增强,检测的灵敏度也高于EB。在紫外照射透视下,与双链DNA接合的SybrGreenI呈现明亮的绿色荧光,但其稳定性较差(怕光、怕热),使得染色的重复性较低。它对于50 bp以下的DNA片段染色能力缺失而对小于l00 bp的DNA片段检测灵敏度也较低。SybrGreenI的使用同样简单,致变性也比EB低,但仍然不能保证实验者的安全性,同时其高昂的价格也限制了它的广泛使用。

GelRed和GelGreen是集高灵敏、安全和高稳定性于一身极佳的荧光核酸染料。其通过美国环保局安全认定,废弃物可直接倒入下水道,而不会造成任何环境污染。目前大多数商业化的核酸染料总是在灵敏度、稳定性和安全性等方面不完全令人满意,而GelRed和GelGreen的上市改变了这一现状。GelRed和GelGreen无论用于预制凝胶染色还是凝胶电泳后的染色,都表现出了极好的实验效果。为配合紫外凝胶成像系统而设计的GelRed,其使用方法与EB一样极其方便简单。GelRed在预制凝胶中使用时仍然有极高的灵敏度,且在检测低浓度、微量DNA方面也表现出极高的灵敏度,尤其对小分子量的DNA检测非常灵敏。GelGreen则可以满足使用蓝色可见光激光凝胶扫描仪或者可见光激发的DarkReader的研究人员的使用。GelGreen无论是在预制凝胶还是凝胶电泳后的染色中都优于SybrGreenI,且不存在后者的不稳定性问题。GelRed和GelGreen均有较强的稳定性,可以长期在室温下保存,且这两种染料的热稳定性也极高,在电泳缓冲溶液中时,均可用微波炉加热且不发生变性。含有染料的预制凝胶可成批制备,长期保存备用。GelRed和GelGreen与EB或SybrGreenI等其他核酸染料相比安全性得到了极大的提高。独立的测试服务公司进行的标准艾姆斯氏测试结果表明,GelRed和GelGreen的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞,正是这一特性保证了实验者的安全,使实验者可以更加放心做实验。

但是,这样的大分子染料也有一个缺点,就是如果配胶的时候染料加多了的话,DNA条带有可能会出现弯曲的情况。因为染料分子量大,太重,让核酸背着这么重的东西还必须跑直线,臣妾真的做不到啊!

不过也不是不能解决,办法有两个:

一、轻装简行。

胶里少加点染料,现在物价这么高,染料加多了也是浪费,100ml胶里加5ul就够观察的了。

二、胶里不加染料,让核酸先跑,没有任何负担的情况下,条带跑的又快又直,姿势还好看,只要等核酸跑到位置之后再扔染料里染色就好了。

 

 By the way,提醒大家:在实验室混,安全还是很重要的,不要把核酸染料捧在手心里,毕竟那个不是优乐美。做实验的时候戴个手套,接触到了化学试剂要马上洗手冲洗。

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