血球计数板的使用及相关问题的分析

在高中阶段的学习中，血球计数板被用来统计酵母菌种群数量的工具。血球计数板是一种常用的微生物细胞计数工具，也是中学生需要掌握的实验技能之一。现就血球计数板的使用及相关问题作一些探讨。

1  血球计数板的结构

血球计数板是一块比普通载玻片大而厚的特制玻璃片。中间有四条漕沟，其间形成三个平台，中央的平台比两边的稍低，加血盖片以后，中央的平台比两边平台低0.1毫米，中央平台的中部被一小漕沟分隔成上下两半，每半边各刻有一个方格网，每个方格网又被分成九大格，其中间的一大格为计数室。每个血球计数板有上下两个计数室，一般选择一个计数室计数即可！

血球计数板有两种规格。一种血球计数板的计数室有25个中格，每个中格有16个小格，共400个小格，总容积为0.1mm³；另一种类型的血球计数板的计数室有16个中格，每个中格有25个小格，一样共400个小格，总容积也为0.1mm³。本文以前一种类型的血球计数板为例进行分析。

2  血球计数板的原理

 通过对一定数量的小格（中格）计数，根据相应小格（中格）所占的体积，可以推算出单位体积的溶液中微生物细胞的密度或总数。

 实验过程中，一般对计数室四角上的四个中方格以及正中间的一个中方格进行统计；对于压线的，采取数上不数下，数左不数右的原则。将五个中格中微生物细胞之和扩大5倍即为一个计数室中微生物细胞的总数。而一个计数室的总容积为0.1mm³，由此即可推算出单位体积或溶液中微生物细胞的密度或总数。

3  血球计数板使用过程中相关问题的分析和讨论

3.1  溶液中微生物细胞总数的推算

假设五个中格中微生物细胞之和为n，则：一个计数室中微生物细胞的总数25/5 * n＝5n，而其溶液体积为0.1mm³，1ml溶液体积为1000mm³。

由此推出：1ml溶液中微生物细胞的总数即为：5n * 10 * 1000＝50000n

3.2  计数时，取样的五个中方格是否存在边缘效应，与样方法取样原则相矛盾？

分析：计数室是位于方格网中九大格的中间的一大格，是计数板上最中央的区域了，当然也就避免了边缘效应的可能！同时，所取的五中格，犹如常用的五点取样法一样，并没有掺杂实验者本身的主观意愿，与随机取样的原则不矛盾。

3.3  计数的微生物细胞是活细胞吗？

    利用血球计数板计数是在显微镜下直接进行的计数，无法判定其死活。当然，也可以通过染色的方法加以区分。

3.4  实验过程中发现，格子中的酵母菌数量过多或有重叠现象，如何处理？

如果发现每小格中酵母菌的个数多于10个，可按以下处理：取1ml酵母菌培养液加入到盛有9ml蒸馏水的试管中，摇匀，再计数；如发现酵母菌的个数仍然过大，则同样再稀释一次，直至每小格中酵母菌的个数介于5-10，并作记录。

3.5  有无方法进一步提高计数的准确性？

可以选用已知浓度的红细胞作比较得出相对数据，这样的方法有利于减少实验操作的误差，而使得结果更准确。具体方法如下：

取1ml待测酵母菌培养液与1ml已知密度的红细胞溶液混合，摇匀，用血球计数板统计出计数室中的酵母菌与红细胞的比例，推算出酵母菌培养液的浓度即可。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。

每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1㎜，所以计数室的容积为0.1㎜3。其计算方法如下：

1．16×25的计数板计算公式

细胞数 ml=(100小格内的细胞数 100)×400×1000×稀释倍数

2．25×16的计数板计算公式

细胞数 ml=(80小格内的细胞数 80)×400×1000×稀释倍数