现代测序技术的发展及应用

    第一代测序技术是Sanger技术，之后测序技术发生了三次变革，产生了二到四次的测序技术，统称为新一代的测序技术。

    第二代测序技术：

    第二代测序技术技术原理是建立在PCR的基础上，直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序，高通量低成本齐头并进。根据其原理分为聚合酶合成测序和连接酶合成测序两类。第二类测序技术较第一代测序技术而言，测序通量明显提高，极大地推进了基因组相关的研究进展，但是测序长度较短，对后续的拼接、组装及注释的生物信息学分析带来了极大的困难。而且扩增后得到的DNA分子片段数目和扩增前比例有相对的偏差，在分析基因表达方面存在较大的弊端。因此序列读长较短和扩增前需要模板扩增步骤，成为第二代技术最集中的弊端所在。这样就需要开发出不经过扩增的单分子测序、读长超过以往的新型测序技术，第三代测序技术应运而生。

    第三代测序技术：

    第三代测序技术的技术标志是单分子测序和长读长。通过在单一DNA分子组成的列阵上进行合成测序。在一个表面积限定的介质上使用单个分子，可以增加独立分析的DNA片段数量，也意味着不再进行昂贵的DNA扩增步骤了，因此，可以使数据产出量更高，而且将进一步降低测序成本。但同时该技术也带来了一些新的挑战，主要集中在单分子水平光学信号的检测方面。主要的问题是要降低没有参与到实际化学反应中的游离荧光分子的背景干扰。解决原则主要是检测局限在测序反应发生的实际位置附近。

在上述两个第二、三代测序技术中，DNA序列都是在荧光等发光物质的协助下，通过DNA聚合酶将不同的dNTP连接到DNA链上，读取此过程中释放出的不同光学信号而间接确定的。这些方法都需要昂贵的光学检测系统，并依赖DNA聚合酶读取碱基序列，这些项目都增加了测序成本。因此开发出不使用生物化学试剂，直接读取DNA序列信息的新型测序方法是非常可取的，由此个成了第四代测序技术的思想。

    第四代测序技术：

    代表当属纳米孔技术，它不需要对DNA样品进行任何生物或化学方面的处理而采用物理方法直接读出其碱基序列。第四代测序的技术特点是完全摒弃了在复杂的DNA聚合酶的生化反应中进行DNA序列的读取，而是利用不同碱基的电化学性质差异，通过纳米孔等直接对碱基穿过电极时的电流变化进行测量实现的。其基本原理可概括为：单个碱基通过纳米孔道时就会引起的电化学性质的变化，而且由于ATCG这四种不同的碱基存在电化学性质的差异，是的他们穿越纳米孔时所引起的电化学参数的变化量也不同。因此，不同的电化学参数变化量也就对应通过纳米孔的相应碱基。

    应用：

    1. 基因组从头测序：基因组从头测序是在没有任何的DNA序列资料的情况下直接对某个物种的基因组进行测序。

    2.  基因组重测序：基因组重测序是针对已知基因组序列的物种而言，重新测序的对象是该物种具有不同性状的其他个体。通过及因子重测序并进行差异信息分析，人们能够快速的进行很多有意义的研究，具有重大的科研价值和产业价值，具体主要有一下几点：

    （1）在群体水平研究物种的进化历史和对环境的适应性。对物种内具有不同表型的合体进行基因组重测序，可以在全基因组水平上找到群体内个体间的DNA差异，包括大量的SNPs和结构变异等变异信息，而这些差异可能与这些个体的变形差异存在相关性。

    （2）基因组重测序可以在全基因组水平扫描出与动植物重要性状相关的变异位点，育种研究中迅速有效的新方法。

    （3）遗传突变、适应进化和表型筛选是创造出带有优良性状突变体的有力工具，基因组重测序技术有利于突变位点的定位和鉴定。

    3. 转录组重测序：转录组重测序（RNA-seq）是从总RNA中富集出单链mRNA经反转录得到双链cDNA，而后对其进行高通量测序分析。可以适用于mRNA测序，基因表达分析，小RNA测序即靶标mRNA的识别。

    4.新一代测序技术对表观遗传学的贡献：表观遗传学是研究在非基因序列改变的前提下，DNA甲基化和组蛋白修饰等所导致的基因表达水平变化。而随着测序技术的发展，产生了表观基因组学的重要研究内容。