小量表达

1．  取单克隆菌落小养过夜

2．  大养50ml，至OD600达0.4-0.6

3．  取1ml培养液，13000rpm，1min 离心收集，30ul水溶，加入30ul 2×SDS loading buffer，－20保存

4．  加入IPTG至 1mM，每隔2hr重复步骤3

5．  配置相应的SDS－PAGE胶

6．  将样在沸水中煮5min，上样10ul，60V跑浓缩胶，120V跑分离胶。

7．  取胶，考马斯亮蓝染色30min，脱色液脱色过夜

大量表达

1．  前三步相同

2．  加入IPTG至1mM，培养6hr

3．  4℃，8000rpm，离心10min，去上清

4．  用10ml 1×PBS重悬沉淀，加入溶菌酶10mg，25℃，30min

5．  加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mM

6．  冰上超生破碎，200W，30S超声，30S间隔，30个循环

7．  加入TritonX－100，至终浓度为1％，室温混合30min以提高融合蛋白的可浓性

8．  4℃，12000rpm，离心10min，分别取上清，沉淀

9．  上清，沉淀同时跑电泳，观察蛋白是在上清还是沉淀中

包涵体中蛋白的纯化

1．  将离心收集的菌体用包涵体蛋白纯化缓冲液洗涤一次

2．  用1/50菌液的上述缓冲液悬浮菌体，按每1ml加入1mg溶菌酶，于25℃水浴30min

3．  加入PMSF至1mM，800W超生破碎菌10min

4．  剪切菌体DNA

5．  5000rpm， 4℃，10min 离心，去上清

6．  25ml上述缓冲液洗涤沉淀3次

7．  用上述缓冲液悬浮至终浓度为0.5mg/ml

8．  悬浮蛋白溶液装入透析袋，于50倍体积透析液I中透析，4℃，10hr

9．  换100倍体积透析液II进行透析，4℃，10hr

10．              换100倍体积透析液III进行透析，4℃，10hr

11．              换100倍体积透析液IV进行透析，4℃，10hr

12．              吸出透析后的蛋白，稍离心除去丝状不溶物，分光光度计测蛋白浓度

His6 标记蛋白过NTA柱纯化

1．  将Ni＋NTA填料从4℃取出，与乙醇混匀，装上柱子

2．  以10倍柱体积的H2O过柱，洗去乙醇

3．  以50ml binging buffer 过柱

4．  蛋白溶液于4℃，12000rpm离心10min，取上清，用bingding buffer稀释至5倍

5．  蛋白稀释液过柱，可适当降低过柱速率，使蛋白与柱充分结合

6．  以50ml washing buffer过柱

7．  以20ml elution buffer过柱，用Eppendorf管接过柱溶液，每管测A280值，与未过柱前所测A280值比较

8．  每管进行SDS-PAGE鉴定蛋白丰度