摘要：

目的：Twist基因在恶性肿瘤细胞上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）中发挥重要作用。本研究选用MDA-MB-231和4T1乳腺癌细胞系和小鼠乳腺癌肝肺转移模型,研究Twist基因和EMT相关标志物波形蛋白（Vimentin）和E钙粘蛋白（E-cadherin）在体内外的表达,探讨水飞蓟宾是否是通过影响Twist基因的表达来调控MDA-MB-231和4T1乳腺癌细胞系发生EMT,进而明确其对恶性乳腺癌肿瘤侵袭转移能力的影响。

方法：1.体外实验：采用具有高转移性的MDA-MB-231和4T1细胞研究水飞蓟宾对两乳腺癌细胞EMT的影响。培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1,采用MTT法检测水飞蓟宾对细胞增殖能力的影响；通过细胞划痕实验检测水飞蓟宾对细胞迁移能力的影响,采用Transwell小室法检测水飞蓟宾对细胞迁移与侵袭能力的影响,分别采用RT-PCR与Western blot检测水飞蓟宾对乳腺癌细胞Twist基因与E钙粘蛋白和波形蛋白表达水平的影响。2.体内实验：在BABL-c小鼠第四乳腺对接种4T1细胞建立乳腺癌肝肺转移模型。根据肿瘤的体积分层后,将小鼠随机分成空白对照组、水飞蓟宾低剂量组（50mg/kg）、中剂量组（100mg/kg）、高剂量组（200mg/kg）,每组8只。水飞蓟宾经腹腔注射,每天一次,连续两周,空白对照组给予同等体积的生理盐水。末次给药的次日取肿瘤及肝、肺组织,通过瘤体积与瘤重评价水飞蓟宾对移植瘤生长的影响,通过肉眼观察和常规HE染色检测水飞蓟宾对肿瘤转移的影响,采用Western Blot检测水飞蓟宾对E钙粘蛋白和波形蛋白表达的影响。

结果：1.体外实验：MTT检测结果显示不同浓度水飞蓟宾（25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml, 200μg/ml）干预后,50-200μg/ml范围内的水飞蓟宾可以不同程度地抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖,并呈现时间和剂量依赖性。根据MTT检测结果,其余细胞实验均选择50-200μg/ml范围内的水飞蓟宾干预细胞24h进行检测。细胞划痕和Transwell小室法实验结果均显示,水飞蓟宾干预后,MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力均减弱,且随药物剂量的增大而更弱,对4T1细胞而言,划痕实验能表明水飞蓟宾可以抑制该细胞的迁移,但是在Tranwell迁移与侵袭实验中对照组和各用药组的4T1细胞均不能透过Transwell的微孔膜。RT-PCR检测结果显示,4T1细胞经不同浓度水飞蓟宾干预后,与对照组相比,Twist基因的相对表达量均降低（*P＜0.05）。同样的MDA-MB-231细胞,在药物干预后,Twist基因的相对表达量也不同程度的降低（p＜0.05）,于高剂量时降低的最为显著。Western Blot检测结果显示,水飞蓟宾干预后,两细胞E钙粘蛋白相对表达量较对照组明显上调（p＜0.05）,波形蛋白相对表达量显著下调（p＜0.05）。2.体内实验结果：腹腔注射低（50 mg/kg）、中（100 mg/kg）、高（200 mg/kg）剂量的水飞蓟宾干预小鼠后,各组的平均瘤重为2.11±0.37g,1.37+0.21g和1.45±0.15g,对照组的平均瘤重为2.18±0.31g,低剂量组与对照组相比瘤重没有差异,而中高剂量组与对照组相比瘤重有显著性差异（p＜0.05）。与对照组相比,各给药组小鼠的瘤体积明显变小（p＜0.05）,说明水飞蓟宾能够抑制4T1移植瘤的生长。水飞蓟宾（50 mg/kg,100 mg/kg,200mg/kg）干预后,肉眼观察肝肺表面转移的结节数,药物组肝表面结节数分别为： 7.09Q0.11个,4.76±0.37个,1.03±0.23个,与对照组10.81±0.15个相比,均有显著性差异（p＜0.05）；而各药物组的肺结节数分别为：9.24±0.28个,6.58±0.19个,2.21±0.13个,与对照组13.72±0.26个相比,均有显著性差异（p＜0.05）；常规HE染色可看出各药物组转移灶的数目及转移灶面积明显减少,说明水飞蓟宾抑制肿瘤的转移。Western Blot检测提示水飞蓟宾干预使肿瘤组织中波形蛋白表达量降低,E钙粘蛋白表达量增加。

结论：（1）水飞蓟宾可以抑制乳腺癌细胞的增殖,降低细胞活力,抑制细胞移植瘤的生长。（2）水飞蓟宾可以下调细胞的Twist基因表达,使E钙粘蛋白表达上调,波形蛋白表达下调,从而抑制EMT转变,有效的抑制了肿瘤的转移能力。