这几天学习了一下流式细胞术，资料来源是BD公司的宣传册，记了一些关于原理的笔记。学完之后，我的理解就是，流式细胞术来检测细胞类型的原理类似于聚类分析。细胞种类多，而不同种类之间则有区别，每一类细胞都有N个参数，而流式细胞术就是检测这些参数，把检测的结果呈现出来供人们分析，在分析时就可以把拥有相同或相似参数的细胞给划为一类。而这里的参数主要就是荧光信号以及细胞的体积等固有信号，前者是用荧光染料标记的，后者则是细胞固有的。

1. 流式细胞术网上查到的有两个英文缩写，一个是Flow Cytometry，缩写为FCM，翻译应为流式细胞术；另外一个是Fluorescence-Activated Cell Sorting,缩写FACS，翻译为荧光激活细胞分拣术。
2. 流式细胞仪的基本结构一般分为部分：光学系统、液流系统、检测与数据处理系统、细胞分选系统（有的没有）。

   http://s12/middle/001IAGNuzy6EAcCNq8Xeb&690

   FCM原理图

    

3. 光学系统作用：主要为激光，检测荧光信号与散射光信号。这里的过程是激光照射到已用荧光素标记的细胞上，细胞激发荧光信号，这个时候的荧光信号是混合的，包含各个波长的信号，再经过一系列透镜将混合的信号一个个分离出来，通过PMT（光电倍增管）来处理。
4. 液流系统：包括鞘液与流动室。
   http://s15/small/001IAGNuzy6EAdifbLUce&690
   液流系统
   
   
   4.1 鞘液：无荧光本底的平衡电解质溶液，鞘液是用以辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，与其呈层流状态，其中鞘液流速固定，而样品流速可调，样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。鞘液与样品液的组成类似于剑鞘，"鞘"即装剑的套子，在外层，鞘液就是如此，剑就是含有细胞的样品。鞘液作用有三：（1）约束样品位于喷嘴中心，提高测量精度；（2）防止样品靠近喷嘴壁，避免堵塞喷嘴；（3）鞘液成分类似于活细胞生存内环境，有利于保持细胞的活性状态。

   4.2 流动室：被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一孔径为 430×180µm 的长方形孔，供细胞单个流过，当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。

   如果有分选模块，则是在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

    

5. 各个参数的理解：参数包括有FSC（前向角散射）,SSC（侧向角散射）,FL（荧光）。
6. 散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（side scatter,SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群。例如区分中性粒细胞、单核细胞，淋巴细胞。
   http://s5/mw690/001IAGNuzy6EAd9TXtW64&690
   利用FSC与SSC区分个别细胞亚型
   
   
   ①前向角散射(FSC, Forward Scatter)：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在 FCM 应用中，选取 FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。一般代表细胞的体积，值越大代表细胞越大。

   ②侧向角散射(SSC, Side Scatter)：侧向角散射是指与激光束正交 90度方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。一般代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。

   注：以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

   FL(fluorescence)：反映颗粒被染上的荧光数量多少

7. FL（fluorescence）荧光信号：经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，经常看到的FL-1，FL-2,FL-3等都表示第几个荧光的意思。一个细胞在通过流动室的时候，可以对其经过激光照射的过程积分，每个积分曲线都可以计算其面积(A)、高度(H)、宽度(W)，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量。

   http://s6/middle/001IAGNuzy6EAcCUCbj75&690

   荧光激发过程的积分

8. Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。