R包GenomiAlignments中的summarizeOverlaps函数在“Union”模式下可以以基因方式对align到的reads进行计数，而得到se对象（summarizedExperiment）。命令行中的dds是DESeq2存储read数的数据集，为DESeqDataSet的缩写，是基于se数据集而进一步拓展得到的。与se相比，dds有两点不同：1是dds矩阵中的值必须是非负整数；2是dds有一个相关联的“design formula”。这个design formula可以理解为告诉DESeq2实验是如何设计的，也就是指定DESeq2的分析。主要是指明metadata table(colData)中哪一个变量明确实验设计，以及这些因子在分析中的使用。差异表达分析中最简单的design formula是“design=~condition”，其中conditon是metadata中的一列，并且注明这些样品分别属于几组中的哪一组。当条件比较多时，design formula可能会变成这样“design=~conditon_1+conditon_2”。

首先得到se对象，然后将se对象转换成DESeq2所需要的dds数据对象，在这一步中加入实验信息，之后调用DESeq2程序对dds进行处理，最后得到结果，非常简洁明了。

se对象的生成是需要预处理得到的，有两种方法：1是从map好的bam文件直接由R包来生成；2是从用其他非R软件如cufflinks得到的read count matrix，再然后使用相应的R包处理生成。这里先以前一种方法为例：

> library("GenomicFeatures") ## 载入GenomicFeatures包。

> hse <- makeTranscriptDbFromGFF("path/to/your/genemodel.gtf",format="gtf") ## 生成转录组信息

> exonsByGene <- exonsBy(hse, by="gene") ## 按照基因来提取exon

> fls <- list.files("path/to/bam/files", pattern="bam$",full=TRUE) ## 读入bam文件，这里给到bam文件所在目录，list.files对给定目录进行列表显示，然后pattern是抓取匹配信息。

> library("Rsamtools") ## 载入Rsamtools包

> bamLst <- BamFileList(fls) ## 生成bam文件

> library("GenomicAlignments") ## 载入GenomicAlignments包

                                              fragments=FALSE/TRUE) ## 生成se对象

    fragments默认是FALSE,其作用是以逻辑判断符来表明是否要将配对read未map上的read进行记数，只在双端测序数据中使用。如果fragments=TRUE，那么singleEnd应该选择FALSE。

（此外，如果我们使用或者已经拥有read count的矩阵，并以此作为输入，也是可行的。不过需要使用DESeqDataSetFromMatrix函数。）

【添加实验信息：】

【去技术性冗余：】

    对于有冗余的片段，可以使用DESeq2包中的collapseReplicates函数进行去冗余。

【差异表达分析：】

    准备好read count矩阵之后开始进行差异表达分析：

> res <- results(dds)    

    一般地，大概几十秒的时间就可以完成分析，如果样品量非常大时可以使用并行来加速运算。加载BioParallel包，并申请所用线程数如下：

> register(MulticoreParam(4)) ##申请4线程

    然后在DESeq命令后添加“parallel=TRUE”，便会使用4线程进行运算。

【结果分析和可视化：】

    差异表达分析结束后按照p-value进行排序，summarize等进行分析。之后绘图可视化。