在真核起始过程中，由Met-tRNAi，eIF-2和GTP形成了三元复合体（ternary complex）再结合40S小亚基形成前起始复合物(preinitiation complex)。此复合物的形成分为二步：首先GTP和eIF-2结合，以增加此因子与Met-tRNA．结合的效率。然后三元复合体再与40S亚基结合。核糖体结合位点由起始密码子所决定，在某些起始密码子上游邻接序列也可能十分重要，被称为Kozak序列(ACCAUGG)，它相当于原核的S-D序列。前起始复合物结合5′7meG帽结构并沿着mRNA扫描，借助Kozak序列搜寻第一个起始密码子。
Kozak规则是基于已知数据的统计结果,所谓Kozak规则,即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律.
若将第一个ATG中的碱基A,T,G分别标为1,2,3位,则Kozak规则可描述如下:
(1)第4位的偏好碱基为G;
(2)ATG的5'端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T;
(3)在-3,-6和-9位置,G是偏好碱基;
(4)除-3,-6和-9位,在整个侧翼序列区,C是偏好碱基

真核引物设计需在ATG前加上GCCACC

1. 不论全长还是部分，在做真核表达时，一般都要带上kozak序列，用部分cDNA时，还要加上ATG。多加一些上游序列对你有利，因为一些上游序列自带KOZAK序列；或其他促进表达的序列。.有利于引物设计，因为从ATG开始设计引物，不是每个基因都可以的。引物扩增时头几个容易错，在上游序序列就没关系了。
2. 加Kozark sequence(GCCACC),kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan