组织总RNA提取（TRIZOL）

器具和耗材

加样器一套、匀浆机、离心机

RNase-free的2ml管、RNase-free的各种规格吸头（1ml、200ul、10ul）

镊子、研苯、保温杯

试剂

    Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase-free水

操作步骤：

  A 准备工作

1．  至少在实验前2小时将180℃干烤过的研钵置-70℃冰箱预冷；

2．  清理实验台面，在台面上铺上报纸（或其他），以免研钵研磨时擦伤台面；

3．  根据样品编号清晰标记RNase-free的2ml管；

4．  每管加1.2mlTrizol试剂，盖好盖子；

5．  将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。

  B 组织研磨和匀浆

1. 取冰冻组织材料50－100mg置于放有液氮的研钵中，在研钵中加液氮研磨成粉末（尽量细），注意持续补充液氮；（如果组织块很小，一般不用研钵研磨，直接加入Trizol，用匀浆器匀浆。）

2. 用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至已装有1.2mlTrizol的离心管中，迅速摇开冰冻组织;

3. 立即用组织匀浆机匀浆，如果没有组织匀浆机可用Votex；

4. 匀浆后置于室温静置5分钟（或更长）。

  C 氯仿抽提去除蛋白和DNA

1.      加入300ul氯仿（每毫升Trizol加0.2ml氯仿），剧烈震荡混匀，室温静置10分钟或更长。

2.      12000g，4℃离心15分钟

  D 沉淀、溶解RNA

1.       将上清液转移到新的2ml离心管中，加入等体积异丙醇（约800ul）（一般，每毫升Trizol加0.5ml异丙醇；但如果加与上清液等体积的异丙醇，会增加RNA尤其是miRNA的得率）；上下颠倒混匀，置-20℃冰箱放置2小时以上（一般，此步是置室温搁置10分钟即可，但如果置-20℃冰箱放置过夜，会增加RNA尤其是miRNA的得率）。

2.       12000g，4℃离心30分钟（一般，离心10分钟即可，但如果离心时间为20-30分钟，会增加RNA尤其是miRNA的得率。另外，我们在提取总RNA用于miRNA分析时，这一步使用25000×g离心15分钟）。

3.       小心去掉上清液，沉淀用2ml 的75%乙醇洗涤（将沉淀飘浮起来即可），不需打碎。

4.       12000g，4℃离心15分钟。（我们在提取总RNA用于miRNA分析时，这一步使用25000×g离心10分钟）

5.       弃掉乙醇，室温干燥沉淀3分钟（注意不要过渡干燥沉淀，否则难以溶解），视沉淀多少将其溶于适量DEPC水中，分装一部分用于质量检测，其余冻存于-70℃冰箱中备用。

  F RNA质量检测

    1. 取1μl样品，1％琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。如果28S和18SrRNA条带清晰整齐，且28S条带的亮度是18S的两倍，说明RNA完整性较好。

2. 浓度测定：取1μl样品，稀释至50ul，测定OD₂₆₀和OD₂₈₀及其比值。若OD₂₆₀/ OD₂₈₀>1.8，说明RNA纯度较好。

对于RNA样品：OD₂₆₀的值为1时，RNA的浓度为40μg/ml,

即：1 OD₂₆₀=40μg/ml RNA, 所以如果稀释倍数为200，则：

RNA样品浓度= OD₂₆₀ × 40μg/ml × 稀释倍数

          = OD₂₆₀ × 40μg/1000μl × 200

   =OD₂₆₀×8（μg/μl）

G 提取RNA注意事项

①Trizol用量为材料的10倍体积，材料过多易造成降解。研磨材料时要保持低温，以防RNA降解。

②RNA干燥时间过长则不易溶解，注意当沉淀边缘变模糊时即可停止干燥，开始溶解。

③实验中所用有机废液应倾倒至指定容器中，以免腐蚀下水管道。

④Trizol有一定毒性，避免接触皮肤和眼睛。

附RNA电泳图谱：

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