绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）自发现以来，由于具有自发荧光等特性，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要的作用。本文通过对绿色荧光蛋白特性的分析，介绍了其作为荧光标记在蛋白质研究中的应用，并展望了进一步的研究前景。

1、绿色荧光蛋白及其特性

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是荧光蛋白（Fluorescent protein, FPs）家族中常用的一种，最初从水母Aequorea victoria中分离得到，现已在多种生物中找到，如：海葵属生物。野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约为27kDa，能够在单独或者与其它蛋白融合时产生荧光。而其最显著的特点是除了氧气之外，不需要其他辅酶。GFP由11个β片层组成桶状构成疏水中心，由α螺旋包含着的发光基团位于其中（图1）。这个发光基团是由3个氨基酸（Ser65、Tyr66、Gly67）经过环化、氧化后形成的咪唑环，在钙离子激发下产生绿色荧光。野生型GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在395nm和470nm处有两个吸收峰，在509nm处有一个主发射峰。通常，GFP在完整并形成正确构型时能够发出荧光。GFP的这个性质使得它在蛋白质研究中具有极其重要的作用。GFP蛋白的特性使它被广泛地用作指示分子，通过与靶蛋白的基因融合，来研究蛋白质的细胞定位、折叠效率与可溶性、蛋白质的表达、蛋白与蛋白之间相互作用、构型的变化等等。作为报告分子，GFP具有很多优点，如实现了活细胞内基因表达和定位、荧光为蛋白的内在属性、荧光发射无种属依赖性、荧光信号对光漂白具有高抗性、检测时不需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表达无明显毒性、具有高度稳定性。另外，细胞内GFP的检测也比较简单，如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等，现有报道利用实时定量PCR进行GFP荧光定量测定的方法。

2、GFP在蛋白质相互作用和构型变化研究中的应用
蛋白质相互作用是生物学研究很重要的一个方面，采用如免疫共沉淀、化学交联、片断层析等技术，已经了解了许多蛋白质的相互作用以及结构基础。但这些生化技术离体研究不能反映活细胞内蛋白质相互作用的情况以及动力学问题。一种活细胞内蛋白质相互作用的研究方法是蛋白质片断互补测定法（protein-fragment complementation assay, PCA）。将标记蛋白在某个位点打开，用片断分别标记两个蛋白。如果被标记蛋白质相互作用，则酶或荧光蛋白片断靠近并重新折叠恢复活性。
Baird等[7]研究人员发现，虽然GFP有紧密的桶状结构和形成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰，当对GFP的N端和C端部分交换重排并以一段间隔重新连接时，GFP仍然具有荧光。并且，GFP的某些位点可以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子的黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein, YFP，GFP的突变体）中145位插入锌指结构能使荧光强度多倍提高。Hu等提出了双分子荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）的概念，用互补的荧光片断标记不同蛋白来研究bZIP和Rel转录因子家族的相互作用，确定了相互作用位置，信号传递对作用位点的调节等，证明了双分子荧光互补实验在蛋白质相互作用研究中的可行性。
荧光互补不仅仅在蛋白质相互作用中有所应用，Jeong等研究人员以与底物结合时会有典型的构象变化麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）为模型，将MBP C端和N端分别与GFP片断融合。结果证明加入底物的一组显示出比对照组更强的荧光，由此提出split-GFP在观察蛋白构型变化中的应用。
另外，一种重要的荧光成像技术—荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）也被广泛应用。它能够利用GFP及其突变体青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）等，定时、定量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象变化、蛋白之间相互作用、信号传递途径。
最近，Pedelacq等经过突变得到一种绿色荧光蛋白超折叠体。这种绿色荧光蛋白不论是在单独表达还是融合表达时都不容易产生荧光的减弱。这些GFP超折叠体将有望在FRET中得到应用。

3、GFP在蛋白表达中的应用
3.1GFP与蛋白可溶性表达
利用大肠杆菌进行蛋白大量表达时，常常会造成蛋白质错误折叠和聚集沉淀。已有的增加蛋白可溶性表达的方法包括—靶蛋白与溶解性好的蛋白融合表达、靶蛋白与促折叠剂及伴侣蛋白共表达、低温表达、改善培养条件等等。但并不适用于所有情况，因为没有从本质上改变控制蛋白折叠和可溶性的因素。Waldo等利用GFP只有在自身折叠正确的情况下产生荧光的特性和能在基因水平操作的优点，将随机突变后的目的蛋白以C端同GFP融合，在大肠杆菌中构建表达文库。荧光筛选和SDS验证表明，GFP的折叠和发光集团的形成与上游蛋白的正确折叠及可溶性直接相关。此后，Pedelacq等进一步利用GFP指示筛选到可溶性提高的甲基转移酶、NDP激酶，并通过X光衍射实验得到了进化的NDP激酶的结构。van den Berg等研究人员利用这种方法，通过易错PCR（error-prone PCR）增加了TEV蛋白酶在大肠杆菌中的可溶性表达。Kawasaki等将T-PCR（tagged random primer PCR）扩增与GFP标记筛选方法相结合，从小鼠Vav蛋白中克隆到4个可溶结构域。
针对GFP折叠报告系统存在的问题，比如在蛋白定向进化中可能得到由于在内部隐蔽核糖体结合位点错误起始翻译造成蛋白截短以及不适合应用于由于缓慢聚集而形成的不溶性蛋白，Cahantous等在GFP折叠报告系统的基础上加入了split-GFP补偿系统，对基于GFP的可溶性蛋白筛选方法进行了改进。
3.2  GFP与蛋白表达条件优化
利用微生物进行蛋白大量表达，寻找能够减少蛋白的非正确折叠的适宜的蛋白表达条件必不可少。然而，传统的筛选步骤，如：免疫转渍分析、琼脂糖凝胶电泳检测等，比较繁琐、费时，并且只能基于个体水平进行，为表达条件的优化带来不便。Omoya等研究人员根据GFP与蛋白融合表达时表现出的特性，以GFP作为标记，通过对hIL-18-GFP在不同表达条件下（培养温度、诱导剂浓度、培养时间）荧光强度的测定，使hIL-18的表达条件得到优化，提高了终产物产量，并通过SDS-PAGE检测对这一结果进行了证实。Rucker等也作了类似研究。

4 总结和展望
绿色荧光蛋白作为一种稳定的自发荧光的标记分子，在分子生物学和细胞生物学领域有广泛的应用。而荧光共振能量转移（FRET）又为GFP的应用提供了进一步的技术支持。但是，野生型GFP的实际应用存在很多问题，比如信号强度弱、复杂的光化学性质等等。目前，实验室中已经得到了很多GFP的突变体，增加了亮度和折叠效率，降低了寡聚作用，带来更稳定的物理化学性质，并且改变了吸收和发射光谱。例如：增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）、人工绿色荧光蛋白（GFPh）、S65T-GFP、蓝色荧光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）、红移型绿色荧光蛋白（red-shifted green fluorescent proein，RSGFP）等。这些GFP的突变体为分子和细胞生物学的发展提供了强大的推动力。
除此之外，GFP蛋白仍有一些不足，主要表现在GFP对靶蛋白可能的影响，如：标记蛋白的表达量增加，影响蛋白的功能和定位。GFP荧光活性形成比较慢，对某些细胞动力学过程不能实时监测。GFP标记检测中也存在一定问题。细胞聚合物、杂质和培养基中其他吸光或散光的化合物，能够形成“内滤现象”（inner filter effect，IFE），影响培养基GFP的荧光检测。
随着生物技术的发展，预计将会得到更多GFP突变体以及模型和计算方法，逐步弥补不足，完善GFP作为分子标记的应用方法。