2´-ACE合成的RNA寡核苷酸参考指南

应用RNA寡聚物

1. 接收RNA
　　此RNA低聚物是通过2-ACE 保护来运输。 其它的所有保护基已经从RNA裂解. 除非有其他方面的要求,所有核苷酸内结合是磷酸盐并且5'-和3'末端都是羟基。 保护核糖核酸的2'-ACE的一般结构如下:
 
　　此2'-保护基共同抵抗核酸酶降解和促进最小化二级结构。 Dharmacon在装运前利用阴离子交换HPLC （高压液相色谱法）分析研究0.5%等分每个2'保护低聚物。 剩下的99.5%等分原始低聚物在真空中干燥，包装并装入为稳定的2'-保护形式以最佳保证匀质性。 2'-保护基在pH 3.8下利用含水的缓冲液（enclosed aqueous buffer ）下30分钟内很容易除去。
　　收到RNA 低聚物后必须存储在-20°C备用。 随每个样品低聚物的说明书可以取出并放入笔记本中供参考。

2. 使用前准备
　　利用含水缓冲液（aqueous buffers ）小于30分钟2'-保护基可被完全除去。 (见讨论机制的附件C) 此亲水性的2'-ACE 保证任何序列或者2'-保护的RNA 长度是水溶性的。 每个低聚物伴随有一个易挥发的脱保护缓冲液和2'-脱保护规程。 此规程被设计成能保证所有2'-羟基全部的脱保护。 (注意:此2'-脱保护受到pH 、时间和温度的综合影响，这些因素的许多的变化,包括缓冲液是可以改变的，如果随后的应用或者利用可取的考虑选择的条件,请联络Dharmacon 研究人员以讨论特殊需要。)
　　全部的一批RNA 可以2'脱保护备用， 换句话说,仅需要什么时再选择去保护并且剩余部分储存在-20°C. 这将保证任何不用的RNA 长期的稳定。 因此已经分装的每个RNA 低聚物被分成多管的,并且可以更进一步地随意分成小的等分。 仅仅等分随意地在无菌水二次溶解RNA ,并且脱水到干燥。 此规程因此须根据脱保护缓冲液的数值成比例校准。 [如果要求另外的缓冲液请联络Dharmacon。 换句话说,缓冲液可利用以下规程产生：醋酸(2.86ml ,0.050moles ，100mM 溶液)首先加入无菌水(496ml )中， 加入50-100微升等分的tetramethlethylenediamine(TEMED 四甲基乙二胺？？)校准pH 到3.80. 通常总共要求800-900微升的TEMED .]
　　2'-脱保护后,RNA置于100mM Acetate -TEMED （四甲基乙二胺醋酸盐）缓冲液,pH 3.8. 此缓冲液可能被冷冻脱水干燥或者通过利用Speed -Vac（真空离心蒸发浓缩器） 以保证没有产物丢失。 标准脱盐技术,例如乙醇沉淀法,反向脱盐盒或者凝胶过滤(例如G25sephadex )可以使用但会引起某些产物损失。 如果RNA 脱保护后被立即纯化，可用加样缓冲液直接装入HPLC （高压液相色谱？？）或者聚丙烯酰胺凝胶。

 
3. 效果
　　平均分段的结合产物是>99%。 因此全长产物micromoles（微摩尔？）产量可通过增加合成比例到0.99^(oligo length -1)来估计。 利用每个说明书上提供的低聚物的分子量可计算milligrams （毫克）产量。 利用1ODU260=33微克转换比可以估计OD 260单位(ODU260)产量。换句话说附件B表可用来对照获得预计产量。

 
4. 纯化
　　合成后原始的RNA 低聚物是HPLC 分析研究并且除去溶剂以备装运。 合成和装运之间没有另外的处理。许多研究人员报道应用原始的RNA 足以完全使用不需更进一步地纯化。 (请注意原始的RNA 和DNA 低聚物有一样高或者更高的质量。） 如果要求更大的均质性或者认为必需的则推荐脱盐或者纯化。 此RNA 低聚物可以通过PAGE 或者阴离子交换HPLC 纯化，2'-保护或者2'-羟基RNA 两者都可以通过PAGE 或者阴离子交换HPLC 纯化。

siRNA用户指南
　　Dharmacon: Dharmacon目前提供三个siRNA选择用于委托合成siRNA低聚物。(Dharmacon同样提供大量合成前siRNA 二倍体。) 选择A提供水溶性、稳定的、2'保护RNA ,收到以后在含水缓冲液中去保护。 2'-保护作用确保RNA 使用以前不降解。双RNA 低聚物可以在相同的作用下同时2'-去保护和退火更进一步地预防抵抗降解。 SiRNA 二倍体能通过乙醇沉淀法直接从含水2'-脱保护/退火作用而脱盐。 脱保护和退火后,RNA 小粒于400µl缓冲液。为了乙醇沉淀,通过添加26µl　5MNaCl 校准溶液到0.3MNaCl，最后加入1500µl纯的乙醇和vortex （旋转）。 样品在干冰或者-20°C培育1到2小时，离心收集RNA 小粒。 除去所有液体并且在200-400µl无菌水中再溶解，通过紫外光谱学(1个260-单位相当于32µgRNA )确定浓度并且继续退火(见下文)。 应该注意原始RNA 产物85%完全长度以上,使siRNAs 凝胶纯化以用于敲低没有必要。 选择b提供此核糖核酸彻底地去保护,脱盐和等分在50纳摩数量。再溶解此舰核糖核酸小粒水中和继续sirna退火(见下文)。 选择C提供纯度>97%的纯化的二倍体siRNAs 。水中再溶解此装运的RNA 二倍体并且继续直接用于转染(见下文)。 此最后选择保证二倍体合适形式并且准备好转染。