ChIP(Chromatin immunoprecipitation) 染色质免疫共沉淀

  染色质免疫共沉淀技术主要应用于验证及探寻体内环境中，蛋白质和DNA的直接相互作用，旨在探索特定蛋白质在DNA上的特定结合序列，常在研究转录调控以及组蛋白修饰中被应用到。

主要应用：（1）ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；
          （2）ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；

          （3）ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；

          （4）RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

实验过程大致为：交联-解交联-超声打碎-免疫沉淀-洗涤-DNA纯化-PCR检测。

 具体操作：

样品准备：培养细胞(若样品为组织，可先培养原代细胞)；固定，或者直接活细胞送样。

 细胞固定：此步骤目的为将结合在DNA上的蛋白用共价形式交联在所结合的位点上，避免在之后的操作步骤中脱离丢失。直接将甲醛加入细胞培养液，摇晃固定10分钟后，迅速加入2.5M甘氨酸解交联5分钟，PBS洗涤，刮下细胞。

 超声打碎：此步骤目的为将长链的DNA打碎成200-1000bp的DNA片段。使用设备是超声水浴锅，EP管在冰水混合物中超声，超声后细胞悬液变得澄清透明。离心取上清。

 免疫沉淀：此步骤是加入特异性抗体和对照IgG，和结合抗体的磁珠（或protein A/G）。经稀释后，超声产物分成两份，分别加入特异性抗体和对照IgG，轮转过夜，第二天加入磁珠轮转4小时。

 洗涤：此步骤是减少非特异性结合。分别用稀释缓冲液、低盐溶液、高盐溶液、氯化锂溶液以及TE缓冲液洗涤共7次。用洗脱缓冲液在65℃洗脱过夜。

 DNA纯化：将洗脱的产物用DNA纯化试剂盒纯化，得到50ul纯化产物，用于检测ChIP结果。

http://s1/mw690/002ZF4cqgy6XqyWT3ped0&690

Chip 以后一般做两种实验:Chip-PCR和Chip-seq

一：Chip-PCR

 Chip -PCR是用来研究chip的这个转录因子和预测的某个基因的启动子是存在结合，集合的区域是哪一段。首先根据预测基因ORF区域上游2000-3000bp范围分段设计引物，一般每300bp设计一套，共合成8-10套引物。将每个样本chip以后的Input；IgG；IP三个样本分别用十个引物进行半定量ＰＣＲ的筛选，如果IP组的样本某套引物能P出条带，说明转录因子和预测基因启动子区域的这段序列存在结合。

QPCR定量富集倍数：将半定量电泳PCR筛选出来的有结合的引物，再用Input和IP样本进行QPCR验证，可算出Chip富集的倍数。

二：Chip-seq 

HiSeq 2000,2x100 测序。 高通量测序

1.DNA质量控制

2.制备文库，质量控制

3.测序

生物信息学分析

1.原始数据处理和数据的质量控制。Raw data processing and data QC

2.拼接，读出的数据的分布并小结。Alignment, reads distribution and summary

3.找到峰值。Peak calling

4.注释峰值。Peak annotation

5.全基因组范围的峰值分布与保守区。Genome-wide peak distribution and conservation

6.发现主题。Motif discovery

7.基因组分析。Gene set analysis

8.基因组水平和感兴趣区域的数据可视化。Visualization of both genome level and regions of interests

染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

 客户提供

 实验材料：ChIP级抗体，5ug/样本；

细胞：大于10E7 ；

动物组织：大于0.1g/样本；

植物组织：5g/样本；

本平台提供

 DNA样品制备、超声破碎及IP电泳图；

PCR电泳图；

实验报告（实验仪器设备、试剂、实验方法、数据分析结果）；