美国希望之城医学中心贝克曼研究所三位作者对iRNA药物设计和开发的关键进展、关键成就、现状及未来、以及新型iRNA路径进行了详细综述。

RNA干扰 (RNAi-动词-干扰，或iRNA/ siRNA-名词-RNA)几乎可以调节所有细胞中mRNA的稳定性和翻译，小的双链RNA可以有效地沉默特定基因的RNA，其临床应用的有效性和安全性仍然面临诸多挑战。2018年8月FDA批准Alnylam公司的首款iRNA药物Patisiran，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(hATTR)的1或2期多发性神经病变的成年患者，标志iRNA时代的开启。

最早在1972年有人发现了正义和反义RNA可以干扰基因合成；整整20年前，有两位作者开创性地发现，秀丽隐杆线虫中发生的转录后基因沉默的原因，是一种双链RNA(dsRNA)，他们将其名命为iRNA。随后(2001年)两位作者报道，21和22个核苷酸dsRNA可在哺乳动物细胞中诱导沉默而不引起非特异性干扰素反应。这些小干扰RNA(siRNAs)很快成为生物学研究中广泛使用的工具，用于抑制几乎任何基因表达。

鉴于siRNA的(干扰)效力、抑制小分子无法企及的蛋白质靶点，令任何有雄心的药物开发人员/公司都无法忽视siRNA。到2003年，已形有多个公司涉足iRNA。然后，使用未修饰的siRNA的首个临床试验，发生免疫相关的毒性及可疑的RNAi作用。第二波临床使用siRNA纳米颗粒制剂，取得重要进展，显示出药效，但出现明显的剂量限制性毒性和疗效不。结果，至2010’s年代初，大公司均退出RNAi领域。

但是，一些小型RNAi公司和学术研究人员，在此前失败的基础上，吸取教训，不断改进触发器设计、序列选择、制剂处方和递送载体/方法；并且，在疾病适应症选择、干预途径验证、临床开发考虑、生产制造方面，考虑更加周全，终于在2018年8月10日迎来首个siRNA药品经FDP批准上市，ONPATTRO(patisiran，一种作用于肝脏的siRNA，用于治疗多发性神经病变的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(hATTR)。目前，肝脏、肾脏和眼部适应症的多种候选药物目前正处于I-III期临床试验阶段，预计未来两年将有更多针对中枢神经系统和其他非肝脏组织的siRNA进行IND。预计未来5年里，随着RNAi新的功能发现、更加特异性的iRNA递送载体(包括全身和局部)，将可能实现新的突破性治疗。

RNAi药物设计，主要需要克服全身给药面临的靶向特异性、脱靶和免疫毒性，以及细胞摄取和内涵体逃逸(就是载体被细胞内吞以后形成内体，为了防止内体中的酶降解iRNA，需要让iRNA迅速逃离内体)等问题；这些问题主要通过基元序列结构、序列选择、RNAi触发器的化学处方、给药途径和辅选择优化等解决。

RNAi途径酶对dsRNA分子的相容性结构有一定要求。RNAi通常是完全碱基配对的dsRNA或短发夹RNA(shRNA)，一般为15-30bp。小于15 bp的dsRNA则无法进行RNAi干预；大于30bp，则可能激活PKR而诱导非特异性细胞毒性。RNAi干扰效率方面的差异、反义链和正义链之间引导链选择偏差、基序与不同化学修饰模式和类型之间相容性差异，可能引起RNAi功能的差异。

RNAi功能差异最大的来源在于是否绕过Dicer酶(一种双链RNA内切酶)。例如，25bp的DsiRNA(经过Dicer酶)和19bp的非Dicer的siRNA之间比较显示，经Dicer处理，则RNAi活性更有效，有更可靠的反义链作为RISC(RNA诱导沉默复合物)的指引。而绕过Dicer切割的siRNA，则可以进行更广泛的化学修饰，从而可以在即便没有纳米颗粒包封的情况下，也有更好的代谢稳定性。

RNAi中的反义链是RISC与mRNA靶标结合的引导链，是RNAi活性的重要决定因素。为了获得最佳的安全性和效力，RNAi药物的反义链必须具有排他选择性。理想dsRNA，需要在反义链5'末端比在正义链5'末端更加富含AU，一旦被载入RISC，引导链与靶mRNA上的结合位点碱基配对，启动RNAi活性。

序列选择还要求避免与其他mRNA脱靶匹配。只要引导链种子区域(5'末端的第2-8个碱基)有与之完美的碱基互补配对，RISC可以潜在地下调任何mRNA，因此iRNA潜在脱靶点的数量都很大。

虽然有一些工具可以辅助序列设计，以获得更好的特异性、减少脱靶性，但(未来)iRNA的设计还是离不开广泛的、经验性的筛选。

RNAi药物的化学修饰具有两个基本功能，一是通过减少内源性免疫激活而提高安全性，二是减少内源核酸内切酶和核酸外切酶降解而提高有效性。此外，化学修饰还可以增强RISC对反义链的选择性47，提高序列选择性以降低脱靶性，以及改变理化特性而增强药物递送。化学修饰可以说非常关键。广泛的研究已经为iRNA提供了一些基于碱基、糖和骨架方面的通用修饰。成功上市首个iRNA的Alnylam公司在这个方面具有丰富的经验。

无论化学修饰如何，dsRNA的大小、亲水性和电荷都会给药物对全身循环、外渗、组织穿透、细胞摄取和内涵体逃逸等带来挑战；必须依靠递送载体来克服这些障碍。现有的载体包括纳米颗粒、脂质纳体米颗粒、聚合物、树枝状大分子、核酸纳米、外泌体、蜂毒肽样肽等。 siRNA常见的配体包括配体、抗体、肽和小分子(例如GalNAc，N-乙酰半乳糖胺)。

给药方法和给药部位也会对RNAi药物的生物利用度和生物分布产生深远影响。现有临床开发中的RNAi药物，包括通过静脉和皮下的全身给药，通过吸入(至肺)、封闭管腔特异性注射(如眼睛或脑脊液)或局部给药(如黑色素瘤瘤内注射)。

纳米颗粒和脂质体纳米递送的siRNA，主要通过静脉给药，可以避免肝脏首过代谢，快速进入靶组织。其缺陷在于，siRNA容易很快被肾脏清除，或者颗粒被单核细胞吞噬清除，以至于siRNA可能还没有来得及充分释放。另外的缺陷可能在于免疫激活。但是，这种方式在生物利用度和生物分布方面，具有重要意义。

注入表皮或皮下脂肪的皮下给药，越来越收到青睐，因为可以减少静脉注射的并发症。与GalNAc耦联的“裸露”RNAi的使用越来越多。皮下给药，可以让药物保持较慢的释放速率，并且还可以进入淋巴系统，为介导摄取进入细胞的受体赢得更多时间恢复。另外，皮下注射更加方便，推注更快。有证据表明，以脂质体颗粒为载体的siRNA制剂在小鼠中可以有效沉默靶标。

RNAi药物的内在药代动力学特性，使得通过全身递送方式，难以达到每个患病组织，局部给药无疑是最适宜的。例如，有用于体表伤口局部缓释给药、心内给药，或者脑脊液给药。局部给药的药效，是全身给药所无法企及的。

Patisiran(Alnylam公司)是用于治疗hATTR(遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性)的siRNA 脂质体纳米粒。hATTR是一种罕见的遗传性危及生命的神经退行性疾病。其病因在于肝脏TTR蛋白基因有> 120个突变，致使TTR淀粉样蛋白在外周神经系统、心脏、胃肠道和其他器官中沉积，患者可患有进行性神经病变、心肌病、行走障碍和各种其他衰弱症状，诊断后中位生存期为5-15年。

Patisiran siRNA(ALN-18328)通过沉默肝细胞中的野生型和突变型TTR mRNA来降低血浆TTR蛋白的水平。ALN-18328未经完全修饰，也没有增强肝细胞摄取的靶向配体，采用脂质体纳米颗粒包埋递送。临床测试阶段为ALN-TTR02，经过精细化修饰，大大提高了体内效力，II期临床中，每三周静脉注射一次，血浆中TTR蛋白减少幅度超过80%。

目前临床阶段的1/3左右的RNAi药物GalNAc耦联的siRNAs，代谢稳定，通过GalNA靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGPRs)，这是肝细胞特异性表达(或者高度表达)的一种内吞型受体。GalNAc是在受损糖蛋白上发现的半乳糖的糖衍生物，在低聚糖侧链中丢失了末端唾液酸残基。ASGPRs在中性pH下与GalNAcs特异性结合，从血液中循环内吞大分子，在酸性pH(~5-6)时释放GalNAc，荷载药物在内体中卸载，释放的ASGPR再循环回到细胞表面再利用。GalNAc- siRNA耦联物具有优异的肝脏生理学、ASGPRs在肝脏特异性分布、GalNAc配体没有毒性，使其成为通过全身RNAi给药向肝细胞递送药物的的近乎理想的方法。与纳米颗粒的制剂相比，GalNAc耦联的寡核苷酸可以通过皮下注射进行药物递送。

Revusiran(Alnylam公司)是第一个进入临床试验的GalNAc-siRNA耦联物。与patisiran相似，revusiran也是靶向TTR mRNA用于治疗hATTR。每个碱基位点都经过化学修饰，有效降低核酸酶的降解，并减弱免疫原性；II期临床实验中，皮下注射可以将血浆TTR水平降低55-90%，副作用很轻，只是注射部位的轻微反应，未见全身免疫激活。III期研究中因为发现周围神经病变和血浆乳酸水平升高而终止。

自从Revusiran发展之后，Alnylam宣布开发了两代siRNA ESC。所谓ESC ( Enhanced stabilization chemistry ) 就是增强的稳定化化学技术，大大减少给药剂量达十倍，因而可以进一步减少安全性担忧。使用该技术的siRNA已经进入临床，结果令人振奋。

对于潜在siRNA药物的测试，使用合适的体外和体内模型，准确预测毒性和效力的重要性不容小觑。不同模型动物，对siRNA和载体的反应不同。 RNAi药物的安全性和效力，很大程度上取决于动物模型转录组中是否存在相应的靶向序列。在小鼠中不引起脱靶效应，完全有可能在人类产生无法耐受的脱靶RNAi活性；类似地，对小鼠基因沉默效果很好，对人类也可能很小。另外，某些人类适应症，可能缺乏具有足够同源靶标的动物疾病模型。

其他相关的重要因素，则包括各种载体复杂性、均匀性、稳定性和安全性。脂质体纳米和聚合物纳米已被广泛用于改善药代动力学，但制造方面可能存在挑战性，另外这一类载体产品的均一性，如颗粒的组成、性质、药物荷载，对临床治疗窗口的建立带来挑战；另外，纳米颗粒在储存或在给药后可能不稳定而释放分解产物，带来毒性风险。类似地，内体溶解类载体如蜂毒肽，可以显著改善RNAi药物的内涵体逃逸，但也有较高的潜在毒性，包括致命毒性。

RNAi药物在肝脏以外使用的主要障碍是内涵体逃逸。据报告，之前的siRNA内涵体逃逸率<0.01%，因此每个细胞中需要有2000-5000个siRNA方可达到最大敲低目标。另外，大多数表面受体(疑为ASGPR，原文未说明)数量在1-10万之间，或者更低，受体循环的周期为90分钟，因此，如果siRNA数量没有达到治疗阈值，可能达不到效果。而对于肝脏，ASGPR在肝细胞表达水平约为50万或更高，再循环周期<20分钟，因此，会有足够的GalNAc-siRNA耦联物在肝细胞中积累，发挥治疗作用。虽然肝脏似乎不太存在内涵体逃逸障碍，但其他器官或组织细胞仍然存在未解决的逃逸问题。之后的研究及技术发展还没有很好地提高内涵体逃逸。

抗体的全身循环时间较长，例如数周，并且有比较好的组织分布，因此，有人尝试抗体-siRNA偶联，例如，2010’s年代中期，基因泰克就实现了定量的、位点特异性的、批量的抗体-siRNA偶联，但效力不好，RNAi活性降低或消除。测试表明，IgG-siRNA在内体区室内的包埋是一个重要的限制因素。最近，Avidity Biosciences开发了新型抗体-siRNA耦联物，据称单次静脉注射后，体内肌肉组织中肌肉生长抑制素mRNA的敲低率> 90%，并且申请了相关专利。

siRNA疏水性修饰具有广泛的组织分布，尽管仍然需要较高的注射剂量，但具有很好的沉默效果。预计疏水性siRNA可能很快进入临床前开发阶段。

最近，外泌体作为全身性RNAi递送的载体，显示出很好的前景。外泌体是由内源细胞产生的天然纳米粒子，用于将诸如microRNA(miRNA)或其他物质运输到远端组织。外泌体载体的优势是，CD47和外泌体上的其他内源性信号配体，可抑制巨噬细胞清除，改善细胞摄取来，增加半衰期。使用cGMP方法产生的外泌体，已经成功地将抗KRAS- siRNA递送至小鼠的转移性胰腺癌肿瘤，显著增加了总体存活率。然而，外泌体在制造放大和颗粒差异性(均一性不好，看来，所以颗粒包装载体可能都有这方面的问题)方面，面临较大挑战。

由于全身递送的固有困难，RNAi局部给药可能是更好的选择；但需要使药物在局部保持较长时间的释放。

DNA和RNA纳米技术的最新发展，为携带siRNA创造了机会。核酸纳米结构(我们本期中介绍的框架核酸，可能就是这种类型)具有精确的分子组成、明确的形状、大小等。主要的障碍在于，核酸具有高度的负电荷，可能加速体循环清除。未修饰的DNA和RNA容易被核酸酶降解、及具有免疫原毒性。

有时候需要停止或者逆转siRNA活性，这时需要有解药，针对siRNA引导链的反义寡核苷酸(ASO)可能可以作为解药。

随着对siRNA机制的了解，对miRNA的作用，可以进一步扩展为抑制特定miRNA的活性，以及阻止特定miRNA的沉默。

与体内天然miRNA相似，人工合成的miRNA可以调节维持细胞的关键发育程序和路径。肿瘤细胞中，某些肿瘤抑制因子miRNA被破坏，人工合成的miRNA则可以通过恢复抑癌基因表达而有助于癌症治疗；某些疾病病因为异常miRNA表达，包括肝炎和心血管疾病，也可以采用类似策略。

miRNA抑制剂也称为Anti-miRs，是化学修饰的ASO，与靶标miRNA的活性链互补，阻止miRNA抑制内源性靶标的表达。

Block-miRs是一段ASO，与mRNA上miRNA的某个结合位点竞争性地结合，也就是保护mRNA上的某个位点免受miRNA结合。

Block-mirs和anti-mirs是互补技术。当意图阻止miRNA仅与一个或几个靶标结合时，block-mir策略是理想的。当给定miRNA(例如，肝细胞中的miR-122)对其他靶标的调节另外对于体内平衡有益或甚至需要时，可能出现这种情况。或者，当特定miRNA异常过表达时，通过抗mir减少靶miRNA活性可能更合适。

dsRNA靶向启动子序列的时候，激活基因转录，而不是抑制。其仅仅适用于未突变的基因。saRNA和siRNA在结构上彼此相同，但功能不同。首个saRNA药物MTL-CEBPA于2016年进入临床试验，用于治疗不能手术的肝癌。 MTL-CEBPA是saRNA的脂质体制剂，增加转录因子CCAAT增强子结合蛋白-α(CEBPA)的表达。

siRNN

siRNN(小干扰中性核糖核酸，和siRNA相似，只是其三磷酸骨架带有大量负电荷，需要修饰和借助于载体才能进入细胞，并由此带来其他问题，包括递送效率、胞内释放等。siRNN则用S-acyl-2-thioethyl (SATE) phosphotriester基团与siRNA三磷酸骨架共价结合，中和其电荷，这样可以直接递送至细胞，在细胞内被水解还原成本来的siRNA，显然，siRNN比siRNA有重要优势。

Patisiran批准上市，表明通过全身给药的RNAi疗法靶向肝脏，已经可以用于临床。全身递送现已成为临床实践。基于GalNAc耦联、代谢稳定的siRNAs，仍处于临床开发阶段，但这些药物在不同肝脏适应症中的效力和安全性是一贯的，值得乐观；其他用于眼睛、肾脏和神经系统的RNAi药物的进展也是如此。目前的许多临床评价siRNA主要针对罕见病，但Alnylam的PCSK9抑制剂Inclisiran(降血脂)、Quark公司治疗肾损伤的QP-1002、用于治疗老年湿性黄斑变性的PF-655等，如果获得批准，可能会被用于更大的患者群体。

如果通过全身给药能够成功靶向肝脏、肾脏以外组织和器官，RNAi疗法将会产生更大的影响。RNAi疗法面临的主要挑战，包括避免肾脏和网状内皮细胞清除、增强外渗和组织灌注、增加在不具备载体内化受体高表达细胞的摄取、改善内涵体逃逸等。这些问题化学家和生物学家密切合作，进行解决。siRNA的另一个挑战是递送载体，或者亟待开发代谢稳定的siRNA、及其耦联的配体，以便可以让药物递送到肝外组织。过去20多年的努力发展证明，这些问题未来将一定会有更多突破。