外周血分离PBMC方法

Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
　　(一)　原理:
　　常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
　　(二)　方法:
　　1.　在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
　　4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
　　5.　末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
　　单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
　　　　　　　　　4个大方格内细胞总数
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀释倍数)
　　　　　　　　　　　　　　4
　　6.　细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活细胞数
　　　　　活细胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　总细胞数
　　用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。　　
(三)　试剂和材料:
　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
　　Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)
　　10％小牛血清RPMI1640
　　0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
　　肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
　　短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
　　无菌干燥注射器针头。
　　碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
　　血球计数板、显微镜、水平式离心机。
　　(四)　注意事项:
　　1.　抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
　　2.　操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
　　3.　用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
　　4.　小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
　　(五)　附录
　　1.　Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
　　　　NaCl 8.0克
　　　　KCl 0.4克

　　　　Na２HPO４·12H２O 0.12克
　　　　KH２HPO４　　　　　　 　　0.06克
　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克
　　　　双蒸水　　　　　　　　　 1000毫克
　　　　1％酚红液　　　　　　　　　 2毫克

　　将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
　　2.　细胞分层液配制法
　　　　9％聚蔗糖　　　　　　　　　24份
　　　　34％泛影葡胺　　　　　　　 10％
　　混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
　　3.　磷酸缓冲液(P
　　原液:
　　A液: 0.2M NaH２PO４溶液
　　　　 NaH２PO４ 　　　　　　　　　　27.6克
　　　　 或NaH２PO４·2H２O 　　　　　　31.2克
　　　　 蒸馏水　溶解至　　　　　　　　1000毫升
　　B液：0.2M Ha２HPO４溶液
　　　　 Ha２HPO４·12H２O 　　　　　　71.6克
　　　　 蒸馏水溶解至1000毫升
　　各种不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
　PH　　　　　7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
　　举例: 　0.1M 　PH7.2PB
　　　　　　A液　　　28毫升
　　　　　　B液　　　72毫升
　　　　　加蒸馏水　 100ml
　　4.　血球保存液
　　葡萄糖　　2.05克　枸椽酸钠　　0.8克
　　氯化钠　　0.42克　蒸馏水　　 100毫升
　　将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。
　　5.　RPMI-1640培养液:

　　　　RPMT-1640(FLOW公司出品)　　　　1袋
　　　　三蒸水　　　　　　　　　　　 1000毫升
　　电磁搅拌30分钟：1N　HCl调PH7.2～7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
　　不完全RPMI-1640培养液:
　　　RPMI-1640　　　　　　　　　　　　　95毫升
　　　0.1M丙酮酸钠　　　　　　　　　　　　1毫升
　　 0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　 1毫升
　　　1M　Hepes 1毫升
　　　7.5％ NaHCO３ 1毫升
　　　青霉素、链霉素(各1万单位)　　　　　　1毫升
　　完全RPMI-1640培养液
　　　不完全1640培养液　　　　　　　　　　90毫升
　　　灭活胎牛(或新生牛)血清　 　　　　　 10毫升
单个核细胞的分离： （密度离心法）

（一） 外周血中的单个核细胞的分离：
1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）
采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：
左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-1mL。

2. 分离PBMC操作步骤：
1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。每1mL全血加0.1mL肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。）
4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度）
5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。
（或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。）
6） 加入５ml的（不含Ca2 ，Mg2 ）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。
（*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板）
7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。
8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。
活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。计数200个细胞，计算活细胞百分率。
单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)×10４×2(稀释倍数)
活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)×100％
　　 用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
3-5毫升外周血可得1×106～2×106PBMC（人）。
鼠可得0.5-1×106PBMC左右
这是我做得步骤 比较成熟 可以参考
谢谢。

人PBMC分离和培养
最后更新：2008-9-5 阅读次数：72 【字体：小 中 大】
1、将静脉血20ｍl用ACD抗凝剂以容积比血：抗凝剂＝9：1抗凝处理
2、按血：分离液＝1：2注入国产淋巴细胞分离液上层，400g 20℃离心30分钟
3、交接层重浮于4倍体积的RPMI1640并通过离心法200g，10min洗三次
4、获得细胞可做分选或其他实验。
体会：
1、实验中我用过肝素方法抗凝，但效果不好，因为肝素抗凝后交接层混浊，洗涤后没有细胞。后来是一位老师推荐我用ACD抗凝剂，效果very good
2、实验用的是国产淋巴细胞液（天津TBD），没有用过进口的Ficoll/Paqnl
3、分层时的离心温度只能在20－25℃，过高细胞容易死亡或破坏，过低分层效果不好。我刚开始不知道，试过用5℃离心，其结果是一塌糊涂
4、不能使用角离心机。

原文地址:http://www.seekbio.com/biotech/exp/Cell/culture/2008/w814243933.html