核酸提取常见问题分析

基因组DNA提取常见问题分析

1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：

        应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA降解。

2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：

        动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。

3．样品量过多导致细胞裂解不充分：

        加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量不同。

4．DNA吸附不充分：

        如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。

5．DNA洗脱不适当：

        洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。

        洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

        洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。

提取的基因组DNA有降解，如何解决?

1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：

        陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。

2．未能有效抑制内源核酸酶作用：

        某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。

3．操作过于剧烈导致DNA被机械打断：

         预处理的样品加入细胞裂解液后，所有操作应尽量柔和，避免振荡、搅拌等剧烈机械力对DNA片段的损伤。

未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？

1．大肠杆菌老化

        请涂布平板培养后，重新桃选新菌落进行液体培养。

2．质粒拷贝数低

        由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

3．菌体中无质粒

        有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，粒查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4．碱裂解不充分

        使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量，对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

5．溶液使用不当

        溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37C保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

6．吸附柱过载

        不同产品中吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2*YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

7．质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）

        洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8．乙醇残留

        漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

9．洗脱液加入位置不正确

        洗脱液应中在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

10．洗脱液不合适

        DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10Mm Tris-HCI,1Mm EDTA ,PH8.5）或水。洗脱效率还取决于PH值，最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

11．洗脱体积太小

        洗脱体积对回收率有一定影响，随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

12．洗脱时间过短

        洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。

用自动荧光测序没有结果，如何解决？

        测序反应体系中DNA的量加得不够，提取的质粒要经过琼脂糖凝胶电泳定量。要使用新鲜的LB培养基和新活化的菌株摇菌。

质粒纯度不高，如何解决？

1．混有蛋白

        不要使用过多菌体，经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。

2．混有RNA

         RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，需在溶液P1中添加RNaseA。

3．混有基因组DNA

        加入溶液P2和P3后应温和温匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中,如果加入溶液P2后过于粘稠,无法温和温匀,请减少菌体用量.细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时。

4．P3溶液加入时间过长

        P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。

5．含大量核酸酶的宿主菌

        宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5 a 和Top10。

6．质粒的二聚体和多聚体形式

        质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。　

RNA降解

1．新鲜细胞：

        如果试剂没有问题，外源性污染也可以排除的话，降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养血中裂解细胞的话,一定要使裂解液能覆盖住细胞。

2．新鲜组织：

        某些富含内源核酸酶的样品（如肝脏，胸腺等），即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

3．冷冻样品：

        样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。

4．外源RNA酶的污染：

        试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。

5．内源RNA酶的污染：

        抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。

OD 260 / OD 280  比值偏低

1．蛋白质污染：

        确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氮仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD 260 / OD 280比值偏低,则用氮仿重新抽提一次,再沉淀,溶解．

2．苯酚残留：

        确保不要吸入中间层及有机相。加入氮仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

3．多糖或多酚的残留：

        一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

4．设备限制：

        测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间.此范围线性最好.用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,PH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。